הדמיה של חלבונים פודוציטיים נפרין, אקטין ופודוצ'ין עם מיקרוסקופיית הרחבה
Summary
השיטה המוצגת מאפשרת הדמיה של חלבונים תאיים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרוסקופיית הרחבה המובילה לרזולוציה של 70 ננומטר על מיקרוסקופ קונבנציונלי.
Abstract
שיבוש המסנן הגלומרולרי המורכב מאנדותל גלומרולרי, קרום מרתף גלומרולרי ופודוציטים, גורם לאלבומינוריה. תהליכי כף הרגל Podocyte מכילים חבילות actin להיקשר חלבונים מתאם cytoskeletal כגון podocin. חלבוני מתאם אלה, כגון podocin, לקשר את עמוד השדרה של הסרעפת חריץ גלומרולרי, כגון nephrin, כדי cytoskeleton actin. לימוד הלוקליזציה והתפקוד של חלבונים פודוציטיים אלה ואחרים חיוני להבנת תפקידו של המסנן הגלומרולרי בבריאות ובמחלות. הפרוטוקול המוצג מאפשר למשתמש לדמיין אקטין, פודוצין ונפרין בתאים עם הדמיה ברזולוציית-על במיקרוסקופ קונבנציונלי. ראשית, תאים מוכתמים בטכניקת כשל חיסוני קונבנציונלית. כל החלבונים בתוך המדגם מעוגנים בקובאליות להידרוגל מתנפח. באמצעות עיכול עם חלבון K, חלבונים מבניים הםבקעו המאפשר נפיחות isotropical של הג’ל בשלב האחרון. דיאליזה של המדגם במים גורמת להרחבה של המדגם פי 4-4.5 וניתן לדמיין את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי, מה שמפחית רזולוציה פוטנציאלית של 70 ננומטר.
Introduction
אלבומינוריה הוא פרמטר פונדקאי של סיכון קרדיווסקולרי ותוצאות שיבוש של מסנן גלומרולרי1. המסנן הגלומרולרי מורכב מאנדותל fenestrated, קרום המרתף גלומרולרי ואת הסרעפת חתך שנוצר על ידי podocytes. תהליכי כף רגל ראשוניים ומשניים של podocytes לעטוף סביב הקיר נימי של גלומרולום2. המבנה העדין של תהליכי כף הרגל נשמר על ידי חבילות actin קליפת המוח אשר משמשים גם עוגנים עבור חלבוני דיאפרגמה חריץ מרובים וחלבונים מתאם אחרים2. חלבון עמוד השדרה של הסרעפת נקרא נפרין ומתקשר באופן הומופילי עם מולקולות נפרין של פודוציטים מנוגדים. באמצעות חלבונים מתאם מגוונים, נפרין מקושר אקטין ציטוסקלטון2,3. מוטציות בגן קידוד הנפרין NPHS1 מובילות לתסמונת נפרוטית מהסוג הפיני4.
אחד החלבונים המקיימים אינטראקציה של nephrin הוא podocin, חלבון דמוי סיכת ראש של משפחת סטומטין3. פודוצ’ין מגייס את נפרין לרפסודות השומנים ומקשר אותה לציטוטוסלקטון5. Podocin מקודד על ידי הגן NPHS2. מוטציות NPHS2 להוביל לתסמונת נפרוטית עמידה בפני סטרואידים6.
כדי לדמיין ולמקם במשותף חלבונים מתאם actin, ניתן להשתמש בטכניקות כשל חיסוני. למרבה הצער, מחסום עקיפה של האור מגביל את הרזולוציה של מיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונבנציונליים ל 200-350 ננומטר7. טכניקות מיקרוסקופיה חדשניות, למשל, דלדול פליטה מגורה (STED)8, מיקרוסקופיה לוקליזציה המופעלת על ידי צילום (PALM)9, מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי (STORM או dSTORM) או מיקרוסקופיית מחיקת מצב קרקע ואחריה החזרת מולקולה בודדת (GSDIM)9,10,11, לאפשר רזולוציה של עד כ 10 ננומטר. עם זאת, טכניקות אלה רזולוציה סופר דורשים מיקרוסקופים יקרים מאוד, כוח אדם מאומן היטב ולכן אינם זמינים במעבדות רבות.
מיקרוסקופיה הרחבה (ExM) היא טכניקה חדשנית ופשוטה המאפשרת הדמיה ברזולוציית על עם מיקרוסקופים קונבנציונליים והיא זמינה לקהילת מחקר גדולה12. במיקרוסקופיית הרחבת שימור חלבונים (proExM), מדגם העניין (תאים או רקמה) קבוע ומוכתם בפלואורופורים13. חלבונים בתוך המדגם מעוגנים אז בקובאליות על ידי מולקולה קטנה (6-(אקרילויל)חומצה הקסאנואית, succinimidyl אסתר, AcX) לתוך הידרוג’ל מתנפח13. באמצעות עיכול אנזימטי עם פרוטאינאז K (ProK), חלבונים ופלואורופורים שומרים על מיקומם היחסי בתוך הג’ל לאחר התרחבות13. לאחר נפיחות של הג’ל, המדגם מתרחב עד פי 4.5 (הרחבה נפחית פי 90) המוביל לרזולוציה רוחבית יעילה של כ 60-70 ננומטר (300 ננומטר / 4.5). שינויים בטכניקה זו יכולים אפילו לאפשר הרחבה של פי 10 (הרחבה נפחית של פי 1,000), מה שמגדיל את הרזולוציה של 20-30 ננומטר במיקרוסקופים קונבנציונליים14,15,16.
מבנים גלומרולריים של עכבר וכליות אדם כבר דמיינו באמצעות ExM17. בתוך נייר זה, אנו מציגים פרוטוקול proExM מפורט כדי לדמיין תמונות ברזולוציה סופר של F-actin ואת podocin חלבון מתאם actin בתוך תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת מאפשרת לחוקר לדמיין חלבונים תאיים, למשל, רכיבים פודוצין, נפרין וציטוסלטל, למשל, F-actin. בתוך פרוטוקול זה, תאי cos7 מוחצים משמשים כמודל לחקר האינטראקציה של חלבוני דיאפרגמה חתוכים עם F-actin. למרבה הצער, קווי תא podocyte מונצחים אינם מבטאים כמויות אנדוגניות מספיקות של חלבוני דיאפרגמה חתוכי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לבלנקה דובנג’אק וניקולה קוהר על הסיוע הטכני המצוין שלהם.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton – Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
