Beeldvorming van Podocytische eiwitten Nephrin, Actine en Podocine met expansiemicroscopie
Summary
De gepresenteerde methode maakt visualisatie van fluorescerend gelabelde cellulaire eiwitten met expansiemicroscopie mogelijk, wat leidt tot een resolutie van 70 nm op een conventionele microscoop.
Abstract
Verstoring van het glomerulaire filter bestaande uit het glomerulaire endotheel, glomerulair keldermembraan en podocyten, resulteert in albuminurie. Podocyte voetprocessen bevatten actinebundels die zich binden aan cytoskeletadaptereiwitten zoals podocine. Deze adaptereiwitten, zoals podocine, verbinden de ruggengraat van het glomerulaire spleetdiafragma, zoals nefhrine, met het actinecytoskelet. Het bestuderen van de lokalisatie en functie van deze en andere podocytische eiwitten is essentieel voor het begrijpen van de rol van het glomerulaire filter bij gezondheid en ziekte. Het gepresenteerde protocol stelt de gebruiker in staat om actine, podocine en nefhrine te visualiseren in cellen met superresolutiebeeldvorming op een conventionele microscoop. Ten eerste worden cellen gekleurd met een conventionele immunofluorescentietechniek. Alle eiwitten in het monster worden vervolgens covalent verankerd aan een zwelbare hydrogel. Door de spijsvertering met proteïnase K worden structurele eiwitten gespleten waardoor isotropische zwelling van de gel in de laatste stap mogelijk is. Dialyse van het monster in water resulteert in een 4-4,5-voudige uitzetting van het monster en het monster kan worden bekeken via een conventionele fluorescentiemicroscoop, waardoor een potentiële resolutie van 70 nm ontstaat.
Introduction
Albuminurie is een surrogaatparameter van cardiovasculair risico en is het gevolg van verstoring van het glomerulaire filter1. Het glomerulaire filter bestaat uit het fenestrated endotheel, het glomerulaire keldermembraan en het spleetmembraan gevormd door podocyten. Primaire en secundaire voetprocessen van podocyten wikkelen zich rond de capillaire wand van het glomerulum2. De delicate structuur van voetprocessen wordt gehandhaafd door corticale actinebundels die ook dienen als ankers voor meerdere spleetmembraaneiwitten en andere adaptereiwitten2. Het ruggengraateiwit van het spleetmembraan wordt nefhrine genoemd en interageert op een homofiele manier met nefhrinemoleculen van tegengestelde podocyten. Via diverse adaptereiwitten is nefhrine gekoppeld aan het actinecytoskelet2,3. Mutaties in het nefrine-coderende gen NPHS1 leiden tot nefrotisch syndroom van het Finse type4.
Een van de interacterende eiwitten van nephrin is podocine, een haarspeldachtig eiwit van de stomatinefamilie3. Podocin rekruteert nephrine aan lipidenvlotten en koppelt het aan het actinecytoskelet5. Podocine is gecodeerd door het NPHS2 gen. Mutaties in NPHS2 leiden tot steroïde-resistent nefrotisch syndroom6.
Om actineadaptereiwitten te visualiseren en te co-lokaliseren, kunnen immunofluorescentietechnieken worden gebruikt. Helaas beperkt de diffractiebarrière van het licht de resolutie van conventionele fluorescentiemicroscopen tot 200-350 nm7. Nieuwe microscopietechnieken, bijv. gestimuleerde emissiedepletie (STED)8, fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM)9, stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM of dSTORM) of aardtoestandverwijderingsmicroscopie gevolgd door individuele molecuulretour (GSDIM)9,10,11, maken een resolutie tot ongeveer 10 nm mogelijk. Deze superresolutietechnieken vereisen echter zeer dure microscopen, goed opgeleid personeel en zijn daarom niet beschikbaar in veel laboratoria.
Expansion microscopy (ExM) is een nieuwe en eenvoudige techniek die superresolutiebeeldvorming met conventionele microscopen mogelijk maakt en mogelijk beschikbaar is voor een grote onderzoeksgemeenschap12. Bij eiwitretentie-expansiemicroscopie (proExM) wordt het interessemonster (cellen of weefsel) gefixeerd en gekleurd met fluoroforen13. Eiwitten in het monster worden vervolgens covalent verankerd door een klein molecuul (6-((Acryloyl)amino)hexaanzuur, succinimidylester, AcX) in een opzwepbare hydrogel13. Door enzymatische vertering met proteïnase K (ProK) behouden eiwitten en fluoroforen hun relatieve positie in de gel na expansie13. Na zwelling van de gel breidt het monster zich uit tot 4,5-voudig (90-voudige volumetrische expansie) wat leidt tot een effectieve laterale resolutie van ongeveer 60-70 nm (300 nm/4,5). Aanpassingen van deze techniek kunnen zelfs een 10-voudige uitbreiding (1.000-voudige volumetrische expansie) mogelijk maken, waardoor een resolutie van 20-30 nm op conventionele microscopen14,15,16wordt weergegeven.
Glomerulaire structuren van muis en menselijke nieren zijn gevisualiseerd via ExM17. In dit artikel presenteren we een gedetailleerd proExM-protocol om superresolutiebeelden van F-actine en de actineadapter eiwitpodocine in cellen te visualiseren met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde methode stelt de onderzoeker in staat om cellulaire eiwitten te visualiseren, bijvoorbeeld podocine, nefhrine en cytoskeletcomponenten, bijvoorbeeld F-actine. Binnen dit protocol worden getransfecteerde cos7-cellen gebruikt als model om de interactie van spleetmembraaneiwitten met F-actine te bestuderen. Helaas drukken vereeuwigde podocytcellijnen onvoldoende endogene hoeveelheden spleetmembraaneiwitten uit19.
Met deze methode kunnen cellulaire eiwitte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Blanka Duvnjak en Nikola Kuhr bedanken voor hun uitstekende technische bijstand.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton – Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
