تصوير البروتينات بودوسيتيك نيفرين، أكتين، وبودوسين مع المجهر التوسع
Summary
تمكن الطريقة المقدمة من تصور البروتينات الخلوية المسماة بالفلورسنت مع المجهر التوسعي مما يؤدي إلى دقة 70 نانومتر على المجهر التقليدي.
Abstract
تعطيل مرشح الكبيبي تتألف من بطانة الرحم الكبيبية، غشاء الطابق السفلي الكبيبي وpodocytes، والنتائج في الزلال. تحتوي عمليات القدم Podocyte على حزم أكتين ترتبط ببروتينات محول الهيكل الخلوي مثل بودوسين. تلك البروتينات محول، مثل بودوسين، ربط العمود الفقري للحجاب الحاجز شق الكبيبي، مثل الكليفرين، إلى الهيكل الخلوي أكتين. دراسة توطين ووظيفة هذه وغيرها من البروتينات podocytic أمر ضروري لفهم دور مرشح الكبيبي في الصحة والمرض. البروتوكول المقدم يمكن المستخدم من تصور أكتين، بودوسين، والنيفرين في الخلايا مع التصوير فائقة الدقة على المجهر التقليدي. أولا، الخلايا ملطخة بتقنية الفلورة المناعية التقليدية. ثم يتم تثبيت جميع البروتينات داخل العينة بشكل متناقض على هيدروجيل قابل للانتفاخ. من خلال الهضم مع البروتين K ، يتم شق البروتينات الهيكلية مما يسمح بتورم إيزوتروبي من الجل في الخطوة الأخيرة. يؤدي غسيل الكلى للعينة في الماء إلى توسيع العينة بمقدار 4-4.5 أضعاف ويمكن تصوير العينة عبر مجهر مضان تقليدي ، مما يجعل الدقة المحتملة 70 نانومتر.
Introduction
الزلال هو معلمة بديلة من مخاطر القلب والأوعية الدموية والنتائج من تعطيل مرشح الكبيبي1. يتكون الفلتر الكبيبي من البطانة الفينيستة، وغشاء الطابق السفلي الكبيبي والحجاب الحاجز الشقي الذي تشكله الخلايا الحبيبية. عمليات القدم الأولية والثانوية من podocytes التفاف حول جدار الشعيرات الدموية من الكبيبة2. يتم الحفاظ على الهيكل الدقيق لعمليات القدم من خلال حزم أكتين القشرية التي تعمل أيضا كمرساة لبروتينات الحجاب الحاجز متعددة الشق وغيرها من البروتينات محول2. ويسمى البروتين العمود الفقري للشق الحاجز الكليرين ويتفاعل بطريقة متجانسة مع جزيئات الكليفرين من podocytes معارضة. عن طريق البروتينات محول متنوعة, ويرتبط الكليفرين إلى الهيكل الخلوي أكتين2,3. الطفرات في الجين NPHS1 ترميز الكلية تؤدي إلى متلازمة الكلى من النوع الفنلندي4.
واحدة من البروتينات المتفاعلة في الكليفرين هو بودوسين، وهو بروتين يشبه دبوس الشعر لعائلة ستوماتين3. بودوسين يجند النيفرين إلى الطوافات الدهون ويربط ذلك إلى الهيكل الخلوي أكتين5. يتم ترميز بودوسين بواسطة الجين NPHS2. الطفرات في NPHS2 تؤدي إلى متلازمة الكلية المقاومة للستيرويد6.
لتصور والمشاركة في توطين البروتينات محول أكتين، يمكن استخدام تقنيات immunofluorescence. لسوء الحظ ، فإن حاجز الحيود للضوء يحد من دقة المجاهر الفلورية التقليدية إلى 200-350 نانومتر7. تقنيات المجهر رواية، على سبيل المثال، حفز استنفاد الانبعاثات (STED)8،الصورة تنشيط المجهر التعريب (PALM)9،مجهرية إعادة البناء البصري العشوائي (العاصفة أو dSTORM) أو المجهر حذف الحالة الأرضية تليها عودة جزيء الفردية (GSDIM)9،10،11،تمكين قرار يصل إلى ما يقرب من 10 نانومتر. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات فائقة الدقة تتطلب مجاهر باهظة الثمن ، وموظفين مدربين تدريبا جيدا ، وبالتالي فهي غير متوفرة في العديد من المختبرات.
المجهر التوسع (إكس إم) هو تقنية جديدة وبسيطة تمكن التصوير فائقة الدقة مع المجاهر التقليدية ويحتمل أن تكون متاحة لمجتمع بحثي كبير12. في المجهر توسيع الاحتفاظ بالبروتين (proExM) ، يتم إصلاح عينة من الفائدة (الخلايا أو الأنسجة) وملطخة بالفلوروفوريس13. ثم ترتكز البروتينات داخل العينة بشكل مكافئ بواسطة جزيء صغير (6-(Acryloyl)amino) حمض الهيكسانويك ، إستر succinimidyl ، AcX) في هيدروجيل قابل للانتفاخ13. من خلال الهضم الأنزيمي مع البروتين K (ProK) ، تحافظ البروتينات والفلوروفوريس على وضعها النسبي داخل الجل بعد التوسع13. بعد تورم الجل ، تتوسع العينة حتى 4.5 أضعاف (توسع حجمي 90 ضعفا) مما يؤدي إلى دقة الجانبية الفعالة من حوالي 60-70 نانومتر (300 نانومتر / 4.5). تعديلات هذه التقنية يمكن أن تسمح حتى لتوسيع 10 أضعاف (1000 أضعاف التوسع الحجمي)، مما يجعل قرار من 20-30 نانومتر على المجاهر التقليدية14،15،16.
وقد تم تصور الهياكل الكبيبية من الفئران والكلى البشرية عن طريق ExM17. ضمن هذه الورقة، نقدم بروتوكول proExM مفصل لتصور صور فائقة الدقة ل F-actin وبوبودوسين البروتين محول أكتين داخل الخلايا باستخدام المجهر الفلوري التقليدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمكن الطريقة المعروضة المحقق من تصور البروتينات الخلوية ، على سبيل المثال ، بودوسين ، نيفرين ، ومكونات الهيكل الخلوي ، على سبيل المثال ، F-actin. ضمن هذا البروتوكول، يتم استخدام خلايا cos7 المصابة كنموذج لدراسة التفاعل بين بروتينات الحجاب الحاجز الشق مع F-actin. لسوء الحظ، خطوط خلايا podocyte الخالدة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود صاحبا البلاغ أن يشكرا بلانكا دوفنياك ونيكولا كوهر على مساعدتهما التقنية الممتازة.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton – Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
