Микроинъекция эмбриона и нокаут-мутантная идентификация CRISPR/Cas9 Генетически отредактированная Helicoverpa Armigera (Hübner)
Summary
Здесь представлен протокол микроинъекции эмбриона Helicoverpa armigera (Hübner) и нокаутирующей мутантной идентификации, созданный путем редактирования генома CRISPR/Cas9. Мутантные насекомые позволяют проводить дальнейшие исследования функции генов и взаимодействия между различными генами in vivo.
Abstract
Хлопковый червь, Helicoverpa armigera, является одним из самых разрушительных вредителей в мире. Сочетание молекулярной генетики, физиологии, функциональной геномики и поведенческих исследований сделало H. armigera модельным видом у Lepidoptera Noctuidae. Для изучения функций in vivo и взаимодействий между различными генами технология редактирования генома кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) / ассоциированного белка 9 (Cas9) является удобным и эффективным методом, используемым для выполнения функциональных геномных исследований. В этом исследовании мы предоставляем пошаговый систематический метод для завершения нокаута гена у H. armigera с использованием системы CRISPR / Cas9. Подробно описаны конструкция и синтез направляющей РНК (гРНК). Затем суммируются последующие этапы, состоящие из генно-специфического дизайна праймера для создания направляющей РНК (гРНК), сбора эмбрионов, микроинъекции, выращивания насекомых и обнаружения мутантов. Наконец, предоставляются рекомендации и заметки по устранению неполадок для повышения эффективности редактирования генов. Наш метод будет служить справочным материалом для применения редактирования генома CRISPR/Cas9 у H. armigera , а также у других чешуекрылых мотыльков.
Introduction
Применение технологии редактирования генома обеспечивает эффективный инструмент для достижения мутантов генов-мишеней у различных видов. Появление системы кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/ассоциированного белка 9 (Cas9) обеспечивает новый метод манипулирования геномами1. Система CRISPR/Cas9 состоит из направляющей РНК (гРНК) и эндонуклеазы Cas92,3, в то время как гРНК может быть дополнительно разделена на две части: целевую комплементарную CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующую crRNA (tracrRNA). ГРНК интегрируется с эндонуклеазой Cas9 и образует рибонуклеопротеин (RNP). С гРНК эндонуклеаза Cas9 может быть направлена на определенный участок генома посредством комплементации основания. Домены RuvC и HNH Cas9 расщепляют целевой участок генома на три основания перед последовательностью протоспейсер-смежных мотивов (PAM) и создают двухцепочечный разрыв (DSB). Затем расщепление ДНК может быть восстановлено с помощью двух механизмов: негомологичного конечного соединения (NHEJ) или гомологического репарации (HDR)4. Восстановление DSB вводит вставки или делеции как способ инактивации целевого гена, потенциально вызывая полную потерю функции гена. Следовательно, углеродистость и специфичность системы CRISPR/Cas9 делают ее надежным методом для характеристики функций генов in vivo и анализа взаимодействий генов5.
С многочисленными достоинствами система CRISPR/Cas9 применяется в различных областях, включая биомедицину6,7, генную терапию8,9 и сельское хозяйство10,11,12, и используется для различных биологических систем, включая микроорганизмы13, растения14,15, нематоды16 и млекопитающих17 . У беспозвоночных многие виды насекомых были подвергнуты редактированию генома CRISPR/Cas9, такие как плодовая муха Drosophila melanogaster и более 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera является одним из самых разрушительных вредителей во всем мире23 и повреждает многочисленные культуры, включая хлопок, сою и сорго24,25. С развитием технологии секвенирования геном H. armigera, а также ряд видов насекомых Lepidoptera были полностью секвенированы 26,27,28,29. Большое количество генов резистентности и обонятельных рецепторов было идентифицировано и охарактеризовано от этих насекомых в последние годы19,27,28,29. Некоторые гены, связанные с резистентностью, были идентифицированы у H. armigera, такие как гены, кодирующие cadherin30, АТФ-связывающий кассетный транспортер31,32, а также HaTSPAN133. Нокаут этих генов с использованием технологии CRISPR/Cas9 приводит к высокому уровню устойчивости к токсину Bacillus thuringiensis (BT) у восприимчивых штаммов. Кроме того, Chang et al. (2017) выбили феромонный рецептор, который подтвердил его важную функцию в регулировании времени спаривания19. Эти отчеты свидетельствуют о том, что CRISPR/ Cas9 может выступать в качестве эффективного инструмента для изучения функции генов in vivo в системах насекомых. Однако подробная процедура модификации CRISPR/Cas9 в системах насекомых остается неполной, что ограничивает диапазон ее применения в функциональной геномике насекомых.
Здесь мы представляем протокол для выбивания функционального гена у H. armigera с использованием системы CRISPR/Cas9. Предоставляется подробный пошаговый протокол, включая разработку и подготовку генно-специфических праймеров для производства гРНК, сбора эмбрионов, микроинъекции, выращивания насекомых и идентификации мутантов. Этот протокол служит ценным справочным материалом для манипулирования любыми функциональными генами у H. armigera и может быть распространен на другие виды чешуекрылых.
Protocol
Representative Results
Discussion
Применение системы CRISPR/Cas9 обеспечило мощную техническую поддержку для анализа функции генов и взаимодействия между различными генами. Подробный протокол, который мы представляем здесь, демонстрирует генерацию гомозиготного мутанта в H. armigera посредством редактирования генома CRISP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31725023, 31861133019 в GW и 31171912 в CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -. Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
