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Behavior

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

Published: July 01, 2021
doi:
10.3791/62068
, , , , ,
1School of Chemical and Environmental Engineering,China University of Mining and Technology, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Shenzhen; Agricultural Genomics Institute at Shenzhen,Chinese Academy of Agricultural Sciences

Summary

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera (Hübner)胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体同定のプロトコルを紹介します。変異昆虫は、生体内の異なる遺伝子間の遺伝子機能および相互作用のさらなる研究を可能にする。

Abstract

コットンボールワーム、 ヘリカバーパアルミゲラは、世界で最も破壊的な害虫の1つです。分子遺伝学、生理学、機能ゲノミクス、行動研究の組み合わせにより、 H. armigera は鱗翅目Noctuidaeのモデル種となっています。異なる遺伝子間の相互作用のインビボ機能を研究するために、クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/関連タンパク質9(Cas9)ゲノム編集技術は、機能的ゲノム研究を行うために使用される便利で効果的な方法である。本研究では、CRISPR/Cas9システムを用いて H. armigera の遺伝子ノックアウトを段階的に体系的に完了させる方法を提供する。ガイドRNA(gRNA)の設計および合成について詳細に説明する。次に、ガイドRNA(gRNA)作成のための遺伝子特異的プライマー設計、胚採取、マイクロインジェクション、昆虫飼育、変異体検出からなるその後の工程をまとめる。最後に、遺伝子編集の効率を向上させるためのトラブルシューティングのアドバイスとメモが提供されています。我々の方法は、 H. armigera および他の鱗翅目の蛾におけるCRISPR/Cas9ゲノム編集の適用のための参照として役立つであろう。

Introduction

ゲノム編集技術の応用は、多様な種において標的遺伝子変異体を達成するための効率的なツールを提供する。クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/関連タンパク質9(Cas9)システムの出現は、ゲノムを操作するための新しい方法を提供します1。CRISPR/Cas9システムはガイドRNA(gRNA)とCas9エンドヌクレアーゼ2,3からなり、gRNAはさらに標的相補的なCRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)の2つの部分に分けることができます。gRNAはCas9エンドヌクレアーゼと統合し、リボヌクレオタンパク質(RNP)を形成する。gRNAを用いると、Cas9エンドヌクレアーゼを塩基相補を介してゲノムの特定の部位に導くことができる。Cas9のRuvCドメインとHNHドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列の3塩基前にゲノムの標的部位を切断し、二本鎖切断(DSB)を作り出します。DNA切断は、非相同末端結合(NHEJ)または相同性指向修復(HDR)4の2つのメカニズムを介して修復することができる。DSBの修復は、標的遺伝子を不活性化する方法として挿入または欠失を導入し、潜在的に遺伝子機能の完全な喪失を引き起こす。したがって、CRISPR/Cas9システムの遺伝性と特異性により、CRISPR/Cas9システムは、生体内の遺伝子機能を特徴付け、遺伝子相互作用を分析するための堅牢な方法となっています5。

CRISPR/Cas9システムは、多くのメリットにより、生物医学6,7、遺伝子治療8,9、農業10,11,12など様々な分野に応用され、微生物13、植物14,15、線虫16、哺乳類17を含む様々な生物系に利用されています。.無脊椎動物では、ショウジョウバエのメラノガスターなど、多くの昆虫種がCRISPR/Cas9ゲノム編集を受けています18,19,20,21,22。

ヘリコバーパ・アルミゲラは世界で最も破壊的な害虫の1つであり23、綿花、大豆、ソルガムなど数多くの作物に被害を与えています24,25。シーケンシング技術の発展に伴い、H. armigeraのゲノム、ならびに鱗翅目昆虫種の範囲のゲノムが完全に配列決定されました26,27,28,29。近年、これらの昆虫から多数の耐性および嗅覚受容体遺伝子が同定され、特徴付けられている19、27、28、29。いくつかの耐性関連遺伝子は、カドヘリン30、ATP結合カセットトランスポーター31、32、ならびにHaTSPAN133をコードする遺伝子など、H. armigeraにおいて同定されている。CRISPR/Cas9技術を用いたこれらの遺伝子のノックアウトは、感受性株におけるバチルス・チューリンゲンシス(BT)毒素に対する高レベルの耐性をもたらす。また、Chang et al. (2017)はフェロモン受容体をノックアウトし、交配時間調節におけるその有意な機能を検証した19。これらの報告は、CRISPR/Cas9が昆虫系における生体内の遺伝子機能を研究するための効果的なツールとして作用し得ることを示唆している。しかしながら、昆虫系におけるCRISPR/Cas9改変の詳細な手順は不完全なままであり、昆虫機能ゲノミクスにおけるその適用範囲が制限されている。

ここでは、CRISPR/Cas9システムを用いて H. armigera の機能遺伝子をノックアウトするためのプロトコルを提示する。gRNA産生、胚採取、マイクロインジェクション、昆虫飼育、および変異同定のための遺伝子特異的プライマーの設計および調製を含む、詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。このプロトコルは、 H. armigera の機能遺伝子を操作するための貴重な参照として機能し、他の鱗翅目種に拡張することができます。

Protocol

1. 遺伝子特異的プライマーの設計とsgRNAの作製 目的の遺伝子内の保存されたゲノム領域を、PCR 増幅およびシーケンシング解析によって検証します。 H. armigera のゲノムDNAから標的遺伝子を増幅し、エクソンとイントロンを区別する。注:ガイド部位の配列特異性は、オフターゲット遺伝子編集を避けるために必要です。エクソン中の探索可能なガイド部位は、遺伝子の5’UTRに近…

Representative Results

このプロトコルは、CRISPR/Cas9技術を用いて H. armigera の遺伝子ノックアウト株を取得するための詳細な手順を提供する。このプロトコールによって得られた代表的な結果は、gDNA選択、胚採取および注入、昆虫飼育、および変異体検出について要約される。 本研究では、我々の目的遺伝子の標的部位は、その第2エクソ…

Discussion

CRISPR/Cas9システムの適用は、遺伝子機能や様々な遺伝子間の相互作用の解析に強力な技術サポートを提供してきました。ここで提示する詳細なプロトコルは、CRISPR/Cas9ゲノム編集による H. armigera におけるホモ接合体変異体の生成を実証する。この信頼性の高い手順は、 H. armigeraにおける指向性遺伝子突然変異誘発のための簡単な方法を提供する。

CRISPR標的部…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学財団(31725023、GW 31861133019、31171912 CY)の支援を受けた。

Materials

2kb DNA ladder TransGen Biotech BM101
Capillary Glass World Precision Instrucments 504949 referred to as "capillary glass" in the protocol
Double Sided Tape Minnesota Mining and Manufacturing Corporation 665
Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector Eppendorf Corporate E5252000021
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf Corporate 5192000051
Eppendorf Microloader Pipette Tips Eppendorf Corporate G2835241
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific A29377
Microscope Slide Sail Brand 7105
Olympus Microscope Olympus Corporation SZX16
PrimeSTAR HS (Premix) Takara Biomedical Technology R040 used for mutant detection
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Company P-1000
TIANamp Genomic DNA Kit TIANGEN Corporate DP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2 Thermo Fisher Scientific A36499
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Ai, D., Wang, B., Fan, Z., Fu, Y., Yu, C., Wang, G. Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner). J. Vis. Exp. (173), e62068, doi:10.3791/62068 (2021).
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