Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde
Summary
Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.
Abstract
Metabolomik, bir hücre, doku, organ, biyolojik sıvı veya organizma içindeki birçok düşük moleküler ağırlıklı ara ve metabolizma ürününün tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılan bir metodolojidir. Metabolomics geleneksel olarak suda çözünen metabolitlere odaklanır. Suda çözünen metabolom, çeşitli genomik, epigenomik, transkriptomik, proteomik ve çevresel faktörleri entegre eden karmaşık bir hücresel ağın son ürünüdür. Bu nedenle, metabolomik analiz, çeşitli organizmalar içindeki çok sayıda biyolojik işlemde tüm bu faktörler için eylemin sonucunu doğrudan değerlendirir. Bu organizmalardan biri tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, tamamen sıralanmış genoma sahip tek hücreli bir ökaryot. S. cerevisiae kapsamlı moleküler analizlere elverişli olduğundan, ökaryotik hücre içindeki birçok biyolojik işlemin altında kalan mekanizmaların parçalanması için bir model olarak kullanılır. Suda çözünen metabolomların sağlam, hassas ve doğru nicel değerlendirmesi için çok yönlü bir analitik yöntem, bu mekanizmaların parçalandırılması için gerekli metodolojiyi sağlayacaktır. Burada, S. cerevisiae hücrelerinden suda çözünen metabolit ekstraksiyonu ve söndürülen metabolik aktivitenin optimize edilmiş koşulları için bir protokol sunuyoruz. Protokol ayrıca, çıkarılan suda çözünen metabolitlerin nicel analizi için tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile birleştirilmiş sıvı kromatografisinin kullanımını açıklar. Burada açıklanan hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemi çok yönlü ve sağlamdır. Bu metabolitlerin farklı yapısal izomerleri ve stereoisomerik formları da dahil olmak üzere çeşitli yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip 370’ten fazla suda çözünür metabolitlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar. Bu metabolitler çeşitli enerji taşıyıcı molekülleri, nükleotitler, amino asitler, monoakkaritler, glikoliz araları ve trikarboksilik döngü aralarını içerir. Hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemi hassastır ve 0,05 pmol/μL’ye kadar düşük konsantrasyonlarda suda çözünen bazı metabolitlerin tanımlanmasına ve nicelleşmesine izin verir. Yöntem, farklı koşullar altında kültürlenmiş vahşi tip ve mutant maya hücrelerinin suda çözünen metabolomlarını değerlendirmek için başarıyla kullanılmıştır.
Introduction
Suda çözünen metabolitler, temel hücresel süreçlere katkıda bulunan düşük moleküler ağırlıklı ara ürünler ve metabolizma ürünleridir. Bu evrimsel olarak korunan süreçler arasında besin maddelerinin kullanılabilir enerjiye dönüştürülmesi, makromolekül sentezi, hücresel büyüme ve sinyalizasyon, hücre döngüsü kontrolü, gen ekspresyonunun düzenlenmesi, stres yanıtı, metabolizmanın çeviri sonrası düzenlenmesi, mitokondriyal işlevselliğin sürdürülmesi, veziküler hücresel kaçakçılık, otofaji, hücresel yaşlanma ve düzenlenmiş hücre ölümü1,2,3sayıldı.
Suda çözünen metabolitlerin bu temel rollerinin çoğu, tomurcuklanan maya S. cerevisiae1 , 3 , 4 , 7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22‘deki çalışmalarla keşfedilmiştir. Bu tek hücreli ökaryot, suda çözünen metabolitlerin gelişmiş biyokimyasal, genetik ve moleküler biyolojik analizlere uygunluğu nedeniyle hücresel süreçlere katkıda bulunduğu mekanizmaların parçalandırılması için yararlı bir model organizmadır23,24,25,26. Hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemleri tomurcuklanan maya 3,18, 22,27’desuda çözünen metabolitlerin rollerini incelemek için kullanılmış olsa da, bu tür analizler çok yönlülüğünün, sağlamlığının, hassasiyetinin ve bu metabolitlerin farklı yapısal izomerleri ve stereoisomerik formlarını ayırt etme yeteneğinin iyileştirilmesini gerektirir.
Son yıllarda, hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemlerinin suda çözünen metabolitlerin in vivo profillemesine uygulanmasında önemli gelişmeler vardır. Bununla birlikte, bu metodolojiyi kullanmada birçok zorluk2,28,29,30,31,32,33,34,35,36olarak kalır. Bu zorluklar aşağıdakileri içerir. İlk olarak, suda çözünür birçok metabolitin hücre içi konsantrasyonları, şu anda kullanılan yöntemler için bir duyarlılık eşiğinin altındadır. İkincisi, metabolik aktivite söndürmenin verimliliği çok düşüktür ve hücre içi metabolitlerin söndürme ile ilişkili hücre sızıntısının boyutu mevcut yöntemler için çok yüksektir; bu nedenle, şu anda kullanılan yöntemler, suda çözünür metabolitlerin hücre içi konsantrasyonlarını az tahmin eder. Üçüncüsü, mevcut yöntemler belirli metabolitlerin yapısal izomerlerini (yani, aynı kimyasal formüle ancak farklı atomik bağlantıya sahip molekülleri) veya stereoisomer’ları (yani, aynı kimyasal formüle ve atomik bağlantıya sahip moleküller, ancak uzaydaki farklı atomik düzenleme ile) ayırt edemez; bu, şu anda kullanılan yöntemlerle belirli metabolitlerin doğru ek açıklamalarını önler. Dördüncüsü, üst iyonların (MS1) ve ikincil iyonların (MS2) mevcut kütle spektral çevrimiçi veritabanları eksiktir; bu, mevcut yöntemlerin yardımıyla üretilen ham LC-MS/MS verilerini kullanarak belirli metabolitlerin doğru tanımlanmasını ve nicelliğini etkiler. Beşinci olarak, mevcut yöntemler suda çözünen metabolitlerin tüm veya çoğu sınıfını kurtarmak için tek bir metabolit ekstraksiyonu kullanamaz. Altıncı olarak, mevcut yöntemler, suda çözünür metabolitlerin tüm veya çoğu sınıfından ayırmak için tek bir LC sütunu türünü kullanamaz.
Burada, S. cerevisiae hücrelerindeki metabolik aktivitenin söndürülmesi, ekstraksiyondan önce bu hücreler içindeki suda çözünen metabolitlerin çoğunun korunması ve maya hücrelerinden suda çözünen metabolitlerin çoğu sınıfının çıkarılması için koşulları optimize ettik. S. cerevisiae hücrelerinden çıkarılan 370’ten fazla suda çözünür metabolitin LC-MS/MS tabanlı tanımlanması ve nicelleştirilmesi için çok yönlü, sağlam ve hassas bir yöntem geliştirdik. Hedefsiz metabolomik bu yöntem, çeşitli enerji taşıyıcı moleküllerinin, nükleotitlerin, amino asitlerin, monoakkaritlerin, glikoliz aralarının ve trikarboksilik döngü aralarının hücre içi konsantrasyonlarını değerlendirmeyi sağlar. Geliştirilen LC-MS/MS yöntemi, farklı yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip suda çözünen metabolitlerin farklı yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının tanımlanmasına ve nicelleştirilmesine izin sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokolü başarıyla kullanmak için aşağıda açıklanan önleyici tedbirleri izleyin. Kloroform ve metanol, laboratuvar plastik eşyalarından çeşitli maddeler çıkarır. Bu nedenle, bunları dikkatli bir şekilde ele alın. Bu iki organik çözücüden herhangi biriyle temas içeren adımlarda plastik kullanımından kaçının. Bu adımlar için borosilikat cam pipetler kullanın. Bu pipetleri kullanmadan önce kloroform ve metanol ile yükseltin. Sadece organik çözücülere dayanıklı po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Titorenko laboratuvarının mevcut ve eski üyelerine tartışmalar için minnettarız. Olağanüstü hizmetler için Kütle Spektrometresi Biyolojik Uygulamalar Merkezi, Yapısal ve Fonksiyonel Genomik Merkezi ve Mikroskopi ve Hücresel Görüntüleme Merkezi’ni (hepsi Concordia Üniversitesi’nde) kabul ediyoruz. Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC) (RGPIN 2014-04482 ve CRDPJ 515900 – 17) tarafından desteklenmiştir. K.M. Concordia Üniversitesi Armand C. Archambault Bursu ve Concordia Üniversitesi Sanat ve Bilim Dekanı Mükemmellik Ödülü tarafından desteklendi.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
References
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
- Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
- López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
- Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
- Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
- Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive ‘hunger factor’ linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
- Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
- Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
- Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
- Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
- Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
- Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
- Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
- Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
- Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
- Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
- Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
- Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
- Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
- Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
- Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
- Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
- Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
- Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
- Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
- Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
- Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
- Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
- Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
- Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
- Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
- Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
