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Biochemistry

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Published: January 05, 2021
doi:
10.3791/62061
, ,
1Department of Biology,Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry,Concordia University

Summary

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Abstract

Metabolômica é uma metodologia utilizada para a identificação e quantificação de muitos intermediários de baixo peso molecular e produtos do metabolismo dentro de uma célula, tecido, órgão, fluido biológico ou organismo. A metabolômica tradicionalmente se concentra em metabólitos solúveis em água. O metabolome solúvel em água é o produto final de uma complexa rede celular que integra vários fatores genômicos, epigenômicos, transcriômicos, proteômicos e ambientais. Assim, a análise metabolômica avalia diretamente o resultado da ação para todos esses fatores em uma infinidade de processos biológicos dentro de diversos organismos. Um desses organismos é o fermento saccharomyces cerevisiae, um eucariote unicelular com o genoma totalmente sequenciado. Como a S. cerevisiae é favorável a análises moleculares abrangentes, é usada como modelo para dissecar mecanismos subjacentes a muitos processos biológicos dentro da célula eucariótica. Um método analítico versátil para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa do metabolome solúvel em água forneceria a metodologia essencial para dissecar esses mecanismos. Aqui apresentamos um protocolo para as condições otimizadas de atividade metabólica saciando e extração metabólito solúvel em água a partir de células de S. cerevisiae. O protocolo também descreve o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para a análise quantitativa dos metabólitos solúveis em água extraídos. O método LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada descrito aqui é versátil e robusto. Permite a identificação e quantificação de mais de 370 metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas, incluindo diferentes isômeros estruturais e formas estereogômicas desses metabólitos. Estes metabólitos incluem várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. O método LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada é sensível e permite a identificação e a quantitação de alguns metabólitos solúveis em água em concentrações tão baixas quanto 0,05 pmol/μL. O método tem sido usado com sucesso para avaliar metabóboles solúveis em água de células de levedura silvestre e mutantes cultivadas em diferentes condições.

Introduction

Metabólitos solúveis em água são intermediários de baixo peso molecular e produtos do metabolismo que contribuem para processos celulares essenciais. Esses processos evolutivamente conservados incluem a conversão de nutrientes em energia utilizável, síntese de macromoléculas, crescimento e sinalização celular, controle do ciclo celular, regulação da expressão genética, resposta ao estresse, regulação pós-translacional do metabolismo, manutenção da funcionalidade mitocondrial, tráfico celular vesicular, autofagia, envelhecimento celular e morte celular regulada1,2,3.

Muitos desses papéis essenciais de metabólitos solúveis em água foram descobertos por estudos na levedura S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Este eucariote unicelular é um organismo modelo útil para dissecar mecanismos através dos quais metabólitos solúveis em água contribuem para processos celulares devido à sua comodidade às análises biológicas bioquímicas avançadas, genéticas e moleculares23,24,25,26. Embora os métodos LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada tenham sido utilizados para estudar os papéis de metabólitos solúveis em água emleveduras brotantes 3,18,22,27, este tipo de análise requer a melhoria de sua versatilidade, robustez, sensibilidade e capacidade de distinguir entre diferentes isômeros estruturais e formas estereotipadas desses metabólicos.

Os últimos anos são marcados por avanços significativos na aplicação dos métodos LC-MS/MS de metabolômica não direcionada ao perfil de metabólitos solúveis em água in vivo. No entanto, muitos desafios no uso dessa metodologia permanecem2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Esses desafios incluem o seguinte. Em primeiro lugar, as concentrações intracelulares de muitos metabólitos solúveis em água estão abaixo de um limiar de sensibilidade para os métodos atualmente utilizados. Em segundo lugar, a eficiência da saciamento da atividade metabólica é muito baixa, e a extensão do vazamento celular associado à extinção de metabólitos intracelulares é muito alta para os métodos atuais; portanto, os métodos atualmente utilizados subestimam as concentrações intracelulares de metabólitos solúveis em água. Em terceiro lugar, os métodos existentes não podem diferenciar os isômeros estruturais (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química, mas conectividade atômica diferente) ou estereomers (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química e conectividade atômica, mas com o arranjo atômico diferente no espaço) de metabólitos específicos; isso impede a anotação correta de certos metabólitos pelos métodos atualmente utilizados. Em quarto lugar, as bases de dados on-line espectrais existentes de íons-pais (MS1) e íons secundários (MS2) estão incompletas; isso afeta a identificação e a quantitação corretas de metabólitos específicos utilizando os dados brutos LC-MS/MS produzidos com a ajuda dos métodos atuais. Em quinto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo de extração metabólito para recuperar todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água. Em sexto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo da coluna LC para separar-se entre si todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água.

Aqui, otimizamos as condições para a extinção da atividade metabólica dentro das células de S. cerevisiae, mantendo a maioria dos metabólitos solúveis em água dentro dessas células antes da extração, e extraindo a maioria das classes de metabólitos solúveis em água de células de levedura. Desenvolvemos um método versátil, robusto e sensível para a identificação e quantificação baseada em LC-MS/MS de mais de 370 metabólitos solúveis em água extraídos de células S. cerevisiae. Este método de metabolomia não-direcionada permite avaliar as concentrações intracelulares de várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. O método desenvolvido LC-MS/MS permite a identificação e quantificação de diferentes isômeros estruturais e formas estereosméricas de metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas.

Protocol

1. Fazer e esterilizar um meio para o cultivo de leveduras Faça 180 mL de um extrato completo de levedura com meio bactopepton (YP). O meio YP completo contém 1% (p/v) extrato de levedura e 2% (w/v) bactopeptone. Distribua 180 mL do meio YP igualmente em quatro frascos de 250 mL Erlenmeyer. Cada um desses frascos contém 45 mL do meio YP. Esterilize os frascos com meio YP autoclavando a 15 psi/121 °C por 45 min. 2. Cepa de levedura tipo selvagem <li…

Representative Results

Para melhorar uma avaliação quantitativa de metabólitos solúveis em água dentro de uma célula de levedura, otimizamos as condições de saciamento celular para detecção metabólito. A extinção celular para este fim envolve uma prisão rápida de todas as reações enzimáticas dentro de uma célula31,33,37,38. Tal apreensão da atividade metabólica ce…

Discussion

Para utilizar com sucesso o protocolo aqui descrito, siga as medidas preventivas descritas abaixo. Clorofórmio e metanol extraem várias substâncias de plásticos de laboratório. Portanto, lide com eles com cautela. Evite o uso de plásticos em etapas que envolvam contato com qualquer um desses dois solventes orgânicos. Use pipetas de vidro borossilicato para estas etapas. Levante essas pipetas com clorofórmio e metanol antes de usar. Use apenas pontas de micropipette e tubos feitos de polipropileno resistente a sol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos aos atuais e antigos membros do laboratório Titorenko pelas discussões. Reconhecemos o Centro de Aplicações Biológicas da Espectrometria de Massa, o Centro de Genômica Estrutural e Funcional e o Centro de Microscopia e Imagem Celular (todos na Universidade de Concórdia) por serviços de destaque. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá (RGPIN 2014-04482 e CRDPJ 515900 – 17). K.M. foi apoiado pela Concordia University Armand C. Archambault Fellowship e pelo Prêmio de Excelência da Universidade de Concórdia.

Materials

Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049
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Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).
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