Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

I metaboliti idrosolubili sono intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo che contribuiscono ai processi cellulari essenziali. Questi processi evolutivamente conservati includono la conversione dei nutrienti in energia utilizzabile, la sintesi di macromolecole, la crescita e la segnalazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la regolazione dell’espressione genica, la risposta allo stress, la regolazione post-traduzionale del metabolismo, il mantenimento della funzionalità mitocondriale, il traffico cellulare vescicolare, l’autofagia, l’invecchiamento cellulare e la morte cellulare regolata^1,2,3.

Molti di questi ruoli essenziali dei metaboliti idrosolubili sono stati scoperti da studi nel lievito in erba S. cerevisiae^{1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22}. Questo eucariota unicellulare è un organismo modello utile per i meccanismi di dissezione attraverso i quali i metaboliti idrosolubili contribuiscono ai processi cellulari grazie alla sua suscettibilità ad analisi biochimiche, genetiche e biologiche molecolari avanzate^23,24,25,26. Sebbene i metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata siano stati utilizzati per studiare i ruoli dei metaboliti idrosolubili nel lievito in erba^3,18,22,27,questo tipo di analisi richiede il miglioramento della sua versatilità, robustezza, sensibilità e capacità di distinguere tra diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti.

Gli ultimi anni sono caratterizzati da progressi significativi nell’applicazione dei metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata alla profilazione di metaboliti idrosolubili in vivo. Tuttavia, molte sfide nell’utilizzo di questa metodologia rimangono^{2,28, 29,30,31,32,33,34,35,36.} Queste sfide includono quanto segue. In primo luogo, le concentrazioni intracellulari di molti metaboliti solubili in acqua sono al di sotto di una soglia di sensibilità per i metodi attualmente utilizzati. In secondo luogo, l’efficienza della tempra dell’attività metabolica è troppo bassa e l’entità della perdita cellulare associata alla tempra dei metaboliti intracellulari è troppo alta per i metodi attuali; quindi, i metodi attualmente utilizzati sottostivalutano le concentrazioni intracellulari dei metaboliti idrosolubili. In terzo luogo, i metodi esistenti non possono differenziare gli isomeri strutturali (cioè molecole con la stessa formula chimica ma diversa connettività atomica) o stereoisomeri (cioè molecole con la stessa formula chimica e connettività atomica, ma con la diversa disposizione atomica nello spazio) di metaboliti specifici; ciò impedisce la corretta annotazione di alcuni metaboliti con i metodi attualmente utilizzati. In quarto luogo, i database online spettrali di massa esistenti di ioni genitori (MS1) e ioni secondari (MS2) sono incompleti; ciò influisce sulla corretta identificazione e quantificazione di metaboliti specifici utilizzando i dati grezzi LC-MS/MS prodotti con l’aiuto dei metodi attuali. In quinto luogo, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di estrazione di metaboliti per recuperare tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua. Sesto, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di colonna LC per separare l’uno dall’altro tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua.

Qui, abbiamo ottimizzato le condizioni per la tempra dell’attività metabolica all’interno delle cellule di S. cerevisiae, mantenendo la maggior parte dei metaboliti idrosolubili all’interno di queste cellule prima dell’estrazione ed estraendo la maggior parte delle classi di metaboliti idrosolubili dalle cellule di lievito. Abbiamo sviluppato un metodo versatile, robusto e sensibile per l’identificazione e la quantificazione basata su LC-MS/MS di oltre 370 metaboliti idrosolubili estratti dalle cellule di S. cerevisiae. Questo metodo di metabolomica non mirata consente di valutare le concentrazioni intracellulari di varie molecole vettore energetico, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS sviluppato consente l’identificazione e la quantificazione di diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche.