Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Les métabolites solubles dans l’eau sont des intermédiaires de faible poids moléculaire et des produits du métabolisme qui contribuent aux processus cellulaires essentiels. Ces processus conservés de manière évolutionnaire comprennent la conversion des nutriments en énergie utilisable, la synthèse de macromolécules, la croissance et la signalisation cellulaires, le contrôle du cycle cellulaire, la régulation de l’expression des gènes, la réponse au stress, la régulation post-traductionnelle du métabolisme, le maintien de la fonctionnalité mitochondriale, le trafic cellulaire vésiculaire, l’autophagie, le vieillissement cellulaire et la mort cellulaire régulée^1,2,3.

Beaucoup de ces rôles essentiels des métabolites solubles dans l’eau ont été découverts par des études dans la levure bourgeonnante S. cerevisiae^1,3,4,7,9,^14,15^{,16,17,18,19,20,21,22}. Cet eucaryote unicellulaire est un organisme modèle utile pour disséquer les mécanismes par lesquels les métabolites solubles dans l’eau contribuent aux processus cellulaires en raison de son aptitude aux analyses biochimiques, génétiques et biologiques moléculaires^avancées23,^24,25,26. Bien que les méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée aient été utilisées pour étudier les rôles des métabolites solubles dans l’eau dans les levures bourgeonnantes^3,18,22,27, ce type d’analyse nécessite l’amélioration de sa polyvalence, de sa robustesse, de sa sensibilité et de sa capacité à distinguer les différents isomères structurels et les formes stéréoisomériques de ces métabolites.

Ces dernières années sont marquées par des progrès significatifs dans l’application des méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée au profilage des métabolites solubles dans l’eau in vivo. Cependant, de nombreux défis dans l’utilisation de^cetteméthodologie^{restent 2,28 , 29,30},^31,32^,33,34,35,36. Ces défis sont les suivants. Premièrement, les concentrations intracellulaires de nombreux métabolites solubles dans l’eau sont inférieures à un seuil de sensibilité pour les méthodes actuellement utilisées. Deuxièmement, l’efficacité de la trempe de l’activité métabolique est trop faible et l’étendue des fuites cellulaires associées à la trempe des métabolites intracellulaires est trop élevée pour les méthodes actuelles; par conséquent, les méthodes actuellement utilisées sous-estiment les concentrations intracellulaires de métabolites solubles dans l’eau. Troisièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas différencier les isomères structuraux (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique mais une connectivité atomique différente) ou les stéréoisomères (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique et la même connectivité atomique, mais avec un arrangement atomique différent dans l’espace) de métabolites spécifiques; cela empêche l’annotation correcte de certains métabolites par les méthodes actuellement utilisées. Quatrièmement, les bases de données en ligne sur le spectral de masse des ions parents (MS1) et des ions secondaires (MS2) sont incomplètes; cela affecte l’identification et la quantification correctes de métabolites spécifiques à l’aide des données brutes LC-MS/MS produites à l’aide des méthodes actuelles. Cinquièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type d’extraction de métabolites pour récupérer toutes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau. Sixièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type de colonne LC pour séparer les unes des autres toutes les classes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau.

Ici, nous avons optimisé les conditions pour la trempe de l’activité métabolique dans les cellules de S. cerevisiae, en maintenant la plupart des métabolites solubles dans l’eau dans ces cellules avant l’extraction et en extrayant la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau des cellules de levure. Nous avons développé une méthode polyvalente, robuste et sensible pour l’identification et la quantification basées sur LC-MS/MS de plus de 370 métabolites solubles dans l’eau extraits de cellules de S. cerevisiae. Cette méthode de métabolomique non ciblée permet d’évaluer les concentrations intracellulaires de diverses molécules porteuses d’énergie, nucléotides, acides aminés, monosaccharides, intermédiaires de glycolyse et intermédiaires du cycle tricarboxylique. La méthode LC-MS/MS développée permet l’identification et la quantification de différents isomères structuraux et formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques.