Işınlanmış Buffy Coat'dan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması
Summary
Bu çalışmada, akış sitometrisi analizi kullanılarak adaptif lökosit alt kümelerinin karakterizasyonu için taze kireçlenmiş aort kapakçıkları örneklerinden T lenfosit izolasyonu sürecini ve T hücre klonlama analitik adımlarını açıklarız.
Abstract
Kapakçığın hafif kalınlaşmasından şiddetli kireçlenmeye kadar uzanan aktif bir hastalık süreci olan kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), transktheter aort kapak replasmanı (TAVR) gibi yeni terapötik seçeneklere rağmen yüksek mortalite ile ilişkilidir.
Kapak kireçlenmesi ile başlayan ve şiddetli aort darlığı ile yol açan tüm yollar sadece kısmen anlaşılmaktadır. Aort kapak hücrelerinin in vivo olarak yakından temsil edilmesini sağlayarak, T lenfositlerinin stenotik kapak dokusundan test edilmesi, kireçlenme gelişimindeki rollerini netleştirmenin etkili bir yolu olabilir. Cerrahi eksizyondan sonra, taze aort kapak örneği küçük parçalar halinde parçalara ayrılır ve T lenfositleri kültürlenir, klonlanır ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanılarak analiz edilir.
Boyama işlemi basittir ve lekeli tüpler paraformaldehitin% 0.5’i kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. Boyama panelinden elde edilen sonuçlar, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde T hücre konsantrasyonlarındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve belirli T hücresi alt türlerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca geliştirilebilir. Bu çalışmada, CAVD patofizyolojisinde adaptif bağışıklığın rolünü daha iyi anlamak için taze kireçlenmiş aort kapak örnekleri üzerinde gerçekleştirilen T hücrelerinin izolasyonunu ve akış sitometrisi kullanarak T hücre klonlarının analiz edilmesinin adımlarını gösteriyoruz.
Introduction
Kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), sağlık hizmetleri üzerinde ağır bir etkisi olan en yaygın kalp kapak hastalıklarından biridir. Son yıllarda aort kapak değişimi sıklığı önemli ölçüde artmıştır ve artan yaşlı nüfus nedeniyle daha da artması beklanmaktadır1.
CAVD’nin alttaki patofizyolojisi sadece kısmen bilinmektedir ve mevcut terapötik stratejiler cerrahi veya perkütan prosedürler yoluyla konservatif önlemler veya aort kapak değişimi ile sınırlıdır. Bugüne kadar, aort kapak değişimi (AVR) yapılmadıkça, etkili hiçbir tıbbi tedavi CAVD ilerlemesini engelleyemez veya tersine çeviremez ve yüksek mortalite erken semptom başlangıcı ile ilişkilidir2. Şiddetli semptomatik aort darlığı olan hastalarda 3 yıllık semptomsuz sağkalım %20 3 gibi düşük bir oranın olduğu bildirilmiştir. Transktheter aort kapak replasmanı (TAVR), özellikle yaşlılar arasında yüksek riskli hastalar için tedavide devrim yapan ve bu popülasyonda özünde yüksek olan mortaliteyi önemli ölçüde azaltan yeni bir seçeneği temsil eder4,5,6. TAVR’ın umut verici sonuçlarına rağmen, yeni erken terapötik hedefleri belirlemek için CAVD patofizyolojisini anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir7,8,9.
Daha önce pasif, dejeneratif bir süreç olduğu düşünülen CAVD, şimdi aort kapak interstisyel hücrelerinin osteoblastik fenotip anahtarı ile karakterize aktif bir ilerleyici hastalık olarak kabul edilmektedir10. Bu hastalık progresif mineralizasyon, fibrokalsifik değişiklikler ve aort kapaklarının (skleroz) azlığı içerir, bu da sonuçta aort kapak açıklığının daralmasına (darlığına) yol açan kan akışını engeller11.
İnflamasyon, vasküler ateroskleroz sürecine benzer şekilde CAVD patofizyolojisinde önemli bir süreç olarak kabul edilir. Endotel yaralanması lipid türlerinin, özellikle de aort kapakçığında oksitlenmiş lipoproteinlerin birikmesini ve birikmesini sağlar12. Bu oksitlenmiş lipoproteinler, mineralizasyona yol açan enflamatuar aktivite ile sitotoksik oldukları için enflamatuar bir tepkiye neden olan bir inflamatuar yanıta nedendir. CAVD gelişiminde ve hastalığın ilerlemesinde doğuştan gelen ve adaptif bağışıklığın rolü son zamanlarda vurgulanmıştır13. Bellek T hücrelerinin belirli alt kümelerinin aktivasyonu ve klonal genişlemesi CAVD ve mineralize aort kapak broşürleri olan hastalarda belgelenmiştir, böylece enflamatuar süreçlerin en azından CAVD gelişiminde ve muhtemelen hastalığın ilerlemesinde rol aldığı varsayılmıştır14. Aslında, hem sağlıklı hem de hastalıklı kapakta antijen sunan hücreler ve makrofajlar mevcut olmasına rağmen, T lenfositlerinin varlığı yaşlı ve hastalıklı bir aort kapakçığının göstergesidir. Bu lenfositik infiltrat, neovaskülarizasyon ve metaplazideki artışla birlikte CAVD15’in karakteristik histolojik belirtileridir.
Aort kapak kesişim hücreleri ile bağışıklık sisteminin aktivasyonu arasında bir etkileşimin varlığını hipotez ediyoruz, bu da aort kapakta kronik bir enflamatuar sürecin başlatılmasını potansiyel olarak tetikliyor. T hücrelerinin stenotik aort kapak dokusundan test edilmesi, aort kapak hücrelerinin in vivo olarak yakından temsil edilmesini sağlayabildiğinden, kireçlenme gelişimindeki rollerini netleştirmenin etkili bir yolu olabilir. Mevcut çalışmada, aort kapak dokusunu kullanarak, T-lenfositleri izole ediyoruz, kültürlüyoruz ve klonlıyoruz ve daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını (FACS) kullanarak karakterize ediyoruz. Şiddetli aort darlığı için cerrahi kapak değişimi alan CAVD hastalarından taze aort kapak örnekleri çıkarıldı. Cerrahi eksizyondan sonra, taze kapak örneği küçük parçalar halinde parçalandı ve T hücreleri kültürlendi, klonlandı ve akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi. Boyama işlemi basittir ve lekeli tüpler paraformaldehitin% 0.5’i kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. Boyama panelinden oluşturulan veriler, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde T lenfosit dağılımındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve belirli T hücresi alt kümelerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca geliştirilebilir.
Kireçlenmiş dokunun çıkarılması, lökositlerin kireçlenmiş dokudan izolasyonu ve özellikle bu tür dokularda akış sitometrisinin kullanılması, otoflüoresans gibi sorunlar nedeniyle zor olabilir. Bu özel amaç için protokollerle çok az yayın var16,17,18. Burada, insan aort kapak örneklerinden T lenfositin doğrudan izolasyonu ve kültürü için özel olarak tasarlanmış bir protokol sunuyoruz. Lenfositlerin klonal genişlemesi adaptif bağışıklığın ayırt edici bir özelliğidir. Bu sürecin in vitro olarak incelenmesi lenfosit heterojenliği seviyesi hakkında içgörülü bilgiler sağlar19. Üç haftalık bir kuluçka süresinden sonra, fenotipik ve fonksiyonel çalışmaya izin vermek için her klondan yeterli miktarda T hücresi elde edildiği için T hücre klonları ekilmeye hazırdır. Daha sonra T klonlarının fenotipi sitoflorometri ile incelenir.
Bu immünolojik protokol, amedei ve arkadaşları tarafından daha önce T hücre izolasyonu ve insan dokusundan karakterizasyon için geliştirilen, özellikle CAVD20,21,22 gibi kireçlenmiş insan dokusu için tasarlanmış bir yöntemin adaptasyonudur. Işınlanmış buffy coat kullanılarak PBMC’lerin (periferik kan mononükleer hücreleri) izolasyonu için buradaki protokol, kapak geçiş hücrelerinden izole edilen T lenfositlerinin klonlama aşaması için özel olarak ayarlanmış besleyici hücreler (FC) elde etmenin etkili bir yolunu açıklar. Besleyici tabaka, hala canlı ve biyoaktif olan büyüme tutuklanığı hücrelerinden oluşur. Besleyici hücrelerin rolü, kapak geçiş hücrelerinden izole edilmiş T lenfositlerinin in vitro sağkalımını ve büyümesini desteklemek için önemlidir23. Kültürde besleyici hücre çoğalmasını önlemek için, bu hücrelerin büyüme hapsine tabi tutulması gerekir. Bu iki şekilde elde edilebilir: ışınlama gibi fiziksel yöntemlerle veya doğrudan kültür yüzeyine uygulanabilen bir antitümöral antibiyotik olan mitomisin C (MMC) gibi sitotoksik kimyasallarla tedavi yoluyla24. Burada hücre ışınlama yoluyla elde edilen besleyici hücre büyümesi tutuklaması gösteriyoruz.
Bu yöntem, T hücrelerini aort kapak dokusundan izole etmek ve karakterize etmek için etkili, uygun maliyetli bir yol sunarak CAVD patofizyolojisini keşfetmek için immünolojik yöntemlerin spektrumunun genişletilmesine katkıda bulunur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada akış sitometrisi kullanarak stenotik aort kapak örneklerinden izole edilmiş T lenfosit subpopulasyonlarını karakterize etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, PBMC’leri izole etmek için ışınlanmış buffy coat kullanılmasını gerektirir. Buffy ceket torbalarının tabi tutulması gereken radyasyon frekansı 9000 Rad/90 Gridir (Gy) ve besleyici hücrelerin çoğalmasını durdurmak için çok önemli bir adımı temsil eder. Buffy ceket torbalarından izole edilen hücrelerin rolü, sadece besley…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokol için kullanılan tüm buffy palto çantaları, Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer ve Charité Benjamin Franklin Radyoloji Bölümü’nün tüm ekibinin mevcudiyeti sayesinde ışınlandı. Burs sahibi/Mary Roxana Christopher, bu çalışma Alman Kardiyak Derneği’nin (DGK) bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: “on-label” versus “off-label” use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of “Not Effector” T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ –adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
