Investigación de la calcificación de la válvula aórtica a través del aislamiento y cultivo de linfocitos T utilizando células alimentadoras de la capa de Buffy irradiada

La enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD) es uno de los trastornos de las válvulas cardíacas más comunes, con un gran impacto en la atención médica. La frecuencia de reemplazo de la válvula aórtica en los últimos años ha aumentado dramáticamente y se espera que aumente aún más, debido a la creciente población de edad ^avanzada1.

La fisiopatología subyacente de la CAVD solo se conoce parcialmente y las estrategias terapéuticas actuales se limitan a medidas conservadoras o reemplazo de la válvula aórtica, ya sea a través de procedimientos quirúrgicos o percutáneos. Hasta la fecha, ningún tratamiento médico eficaz puede dificultar o revertir la progresión de la CAVD y la alta mortalidad se asocia con el inicio temprano de los síntomas, a menos que se realice el reemplazo de la válvula aórtica (^RVA)2. En pacientes con estenosis aórtica sintomática grave, la supervivencia sin síntomas a 3 años se informó tan baja como 20%³. El reemplazo transcatéter de la válvula aórtica (TAVR) representa una nueva opción, revolucionando el tratamiento para pacientes de alto riesgo, especialmente entre los ancianos y ha reducido drásticamente la mortalidad, que era intrínsecamente alta en esta población4,5,6. A pesar de los prometedores resultados del TAVR, es necesaria más investigación para comprender la fisiopatología de la CAVD para identificar nuevas dianas terapéuticas tempranas7,8,9.

Anteriormente se pensaba que era un proceso pasivo y degenerativo, la CAVD ahora se reconoce como una enfermedad progresiva activa, caracterizada por un interruptor de fenotipo osteoblástico de las células intersticiales de la válvula aórtica10. Esta enfermedad implica mineralización progresiva, cambios fibrocalcificantes y reducción de la motilidad de las valvas de la válvula aórtica (esclerosis), que en última instancia obstruyen el flujo sanguíneo y conducen al estrechamiento (estenosis) de la abertura de la válvula ^aórtica11.

La inflamación se considera un proceso clave en la fisiopatología de la CAVD, similar al proceso de aterosclerosis vascular. La lesión endotelial permite la deposición y acumulación de especies lipídicas, especialmente lipoproteínas oxidadas en la válvula ^aórtica12. Estas lipoproteínas oxidadas provocan una respuesta inflamatoria, ya que son citotóxicas, con la actividad inflamatoria que conduce a la mineralización. Recientemente se ha destacado el papel de la inmunidad innata y adaptativa en el desarrollo de la CAVD y la progresión de la ^enfermedad13. Se ha documentado la activación y expansión clonal de subconjuntos específicos de células T de memoria en pacientes con CAVD y valvas de válvula aórtica mineralizadas, de modo que se supone que los procesos inflamatorios están involucrados al menos en el desarrollo de CAVD y presumiblemente también en la progresión de la ^enfermedad14. De hecho, aunque las células presentadoras de antígenos y los macrófagos están presentes tanto en la válvula sana como en la enferma, la presencia de linfocitos T es indicativa de una válvula aórtica envejecida y enferma. Este infiltrado linfocítico junto con un aumento de la neovascularización y la metaplasia son signos histológicos característicos de ^CAVD15.

Planteamos la hipótesis de la existencia de una interacción entre las células intersticiales de la válvula aórtica y la activación del sistema inmune, lo que potencialmente desencadena el inicio de un proceso inflamatorio crónico en la válvula aórtica. El ensayo de células T a partir del tejido de la válvula aórtica estenótica podría ser una forma eficiente de aclarar su papel en el desarrollo de la calcificación, ya que puede proporcionar una representación cercana de las células de la válvula aórtica in vivo. En el presente trabajo, utilizando tejido valvular aórtico, aislamos linfocitos T, los cultivamos y clonamos, y posteriormente los caracterizamos mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se extirparon muestras frescas de válvula aórtica de pacientes con CAVD que recibieron reemplazo quirúrgico de la válvula para la estenosis aórtica grave. Después de la escisión quirúrgica, la muestra de válvula fresca se diseccionó en pequeños trozos y las células T se cultivaron, se clonaron y luego se analizaron mediante citometría de flujo. El procedimiento de tinción es simple y los tubos teñidos se pueden fijar con 0.5% de paraformaldehído y analizarse hasta 15 días después. Los datos generados a partir del panel de tinción se pueden utilizar para rastrear los cambios en la distribución de linfocitos T a lo largo del tiempo en relación con la intervención y podrían desarrollarse fácilmente para evaluar los estados de activación de subconjuntos específicos de células T de interés.

La extracción de tejido calcificado, el aislamiento de leucocitos del tejido calcificado y particularmente el uso de la citometría de flujo en este tipo de tejido puede ser un desafío, debido a problemas como la autofluorescencia. Existen pocas publicaciones con protocolos para este fin específico16,17,18. A continuación presentamos un protocolo diseñado específicamente para el aislamiento directo y el cultivo de linfocitos T a partir de muestras de válvula aórtica humana. La expansión clonal de los linfocitos es un sello distintivo de la inmunidad adaptativa. El estudio in vitro de este proceso proporciona información perspicaz sobre el nivel de heterogeneidad de los ^linfocitos19. Después de un período de incubación de tres semanas, los clones de células T están listos para ser explantados, ya que se obtuvo una cantidad adecuada de células T de cada clon, para permitir el estudio fenotípico y funcional. Posteriormente se estudia el fenotipo de los clones T mediante citofluorometría.

Este protocolo inmunológico es una adaptación de un método previamente desarrollado por Amedei et al. para el aislamiento y caracterización de células T a partir de tejido humano, especialmente diseñado para tejido humano calcificado, como en CAVD20,21,22. El protocolo aquí para el aislamiento de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) utilizando una capa buffy irradiada describe una forma efectiva de obtener células alimentadoras (FC), específicamente ajustadas para la fase de clonación de linfocitos T aislados de células intersticiales valvulares. La capa alimentadora consiste en células detenidas por el crecimiento, que aún son viables y bioactivas. El papel de las células alimentadoras es importante para apoyar la supervivencia in vitro y el crecimiento de linfocitos T aislados de células intersticiales ^valvulares23. Para evitar la proliferación de células alimentadoras en cultivo, estas células deben someterse a una detención del crecimiento. Esto se puede lograr de dos maneras: a través de métodos físicos como la irradiación, o mediante el tratamiento con productos químicos citotóxicos, como la mitomicina C (MMC), un antibiótico antitumoral que se puede aplicar directamente a la superficie de ^cultivo24. Aquí mostramos la detención del crecimiento de las células alimentadoras lograda a través de la irradiación celular.

Este método presenta una forma eficiente y rentable de aislar y caracterizar las células T del tejido de la válvula aórtica, lo que contribuye a ampliar el espectro de métodos inmunológicos para explorar la fisiopatología de la CAVD.