Исследование кальцификации аортального клапана путем выделения и культивирования Т-лимфоцитов с использованием фидерных клеток из облученной шерсти Баффи

Заболевание кальцификального аортального клапана (CAVD) является одним из наиболее распространенных нарушений сердечного клапана, оказывающих сильное влияние на здравоохранение. Частота замены аортального клапана в последние годы резко возросла и, как ожидается, будет увеличиваться и дальше, в связи с ростом пожилого ^{населения1}.

Основная патофизиология CAVD известна лишь частично, и современные терапевтические стратегии ограничены консервативными мерами или заменой аортального клапана, либо хирургическими, либо чрескожными процедурами. На сегодняшний день никакое эффективное медицинское лечение не может препятствовать или обращать вспять прогрессирование CAVD, а высокая смертность связана с ранним появлением симптомов, если не выполнена замена аортального клапана (AVR)². У пациентов с тяжелым симптоматическим стенозом аорты 3-летняя безсимптомная выживаемость составляла всего 20%³. Транскатетерная замена аортального клапана (TAVR) представляет собой новый вариант, революционизирующий лечение пациентов с высоким риском, особенно среди пожилых людей, и резко снизил смертность, которая была по своей сути высокой в этой популяции4,5,6. Несмотря на многообещающие результаты TAVR, необходимы дальнейшие исследования для понимания патофизиологии CAVD для выявления новых ранних терапевтических целей7,8,9.

Ранее считавшийся пассивным, дегенеративным процессом, CAVD теперь признан активным прогрессирующим заболеванием, характеризующимся остеобластным фенотипом интерстициальных клеток аортального ^{клапана10}. Это заболевание включает прогрессирующую минерализацию, фиброкальцификальные изменения и снижение подвижности листков аортального клапана (склероз), которые в конечном итоге препятствуют кровотоку, приводя к сужению (стенозу) отверстия аортального ^{клапана11}.

Воспаление считается ключевым процессом в патофизиологии CAVD, похожим на процесс атеросклероза сосудов. Повреждение эндотелия позволяет откладывать и накапливать липидные виды, особенно окисленные липопротеины в аортальном ^{клапане12}. Эти окисленные липопротеины провоцируют воспалительную реакцию, так как они цитотоксичны, а воспалительная активность приводит к минерализации. Недавно была подчеркнута роль врожденного и адаптивного иммунитета в развитии CAVD и прогрессировании ^{заболевания13}. Активация и клональное расширение специфических подмножеств Т-клеток памяти были задокументированы у пациентов с CAVD и минерализованными листочками аортального клапана, так что предполагается, что воспалительные процессы участвуют, по крайней мере, в развитии CAVD и, по-видимому, в прогрессировании ^{заболевания14}. Фактически, хотя антигенпрезентирующие клетки и макрофаги присутствуют как в здоровом, так и в больном клапане, присутствие Т-лимфоцитов свидетельствует о стареющем и больном аортальном клапане. Этот лимфоцитарный инфильтрат наряду с увеличением неоваскуляризации и метаплазии являются характерными гистологическими признаками ^CAVD15.

Выдвигается гипотеза о существовании взаимодействия между интерстициальными клетками аортального клапана и активацией иммунной системы, что потенциально провоцирует инициацию хронического воспалительного процесса в аортальном клапане. Анализ Т-клеток из стенотической ткани аортального клапана может быть эффективным способом уточнения их роли в развитии кальцификации, поскольку он может обеспечить близкое представление клеток аортального клапана in vivo. В настоящей работе, используя ткань аортального клапана, мы изолируем Т-лимфоциты, культивируем и клонируем их, а затем характеризуем их с помощью флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Свежие образцы аортального клапана были вырезаны у пациентов с CAVD, которые получили хирургическую замену клапана при тяжелом аортальном стенозе. После хирургического иссечения свежий образец клапана рассекали на небольшие кусочки, а Т-клетки культивировали, клонировали, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Процедура окрашивания проста, и окрашенные трубки могут быть зафиксированы с использованием 0,5% параформальдегида и проанализированы до 15 дней спустя. Данные, полученные с панели окрашивания, могут быть использованы для отслеживания изменений в распределении Т-лимфоцитов с течением времени в отношении вмешательства и могут быть легко дополнительно разработаны для оценки состояний активации конкретных подмножеств Т-клеток, представляющих интерес.

Извлечение кальцинированной ткани, выделение лейкоцитов из кальцинированной ткани и, в частности, использование проточной цитометрии на этом типе ткани могут быть сложными из-за таких проблем, как автофлуоресценция. Существует несколько публикаций с протоколами для этой конкретной цели16,17,18. Здесь мы представляем протокол, разработанный специально для прямого выделения и культивирования Т-лимфоцитов из образцов аортального клапана человека. Клональное расширение лимфоцитов является отличительной чертой адаптивного иммунитета. Изучение этого процесса in vitro дает проницательную информацию об уровне гетерогенности ^{лимфоцитов19}. После трехнедельного инкубационного периода клоны Т-клеток готовы к эксплантации, так как из каждого клона было получено достаточное количество Т-клеток, чтобы позволить фенотипическое и функциональное исследование. Впоследствии фенотип Т-клонов изучается методом цитофторометрии.

Этот иммунологический протокол является адаптацией метода, ранее разработанного Amedei et al. для выделения и характеристики Т-клеток из тканей человека, специально разработанных для кальцинированных тканей человека, таких как в CAVD20,21,22. Протокол здесь для выделения PBMCs (мононуклеарных клеток периферической крови) с использованием облученной пухлой оболочки описывает эффективный способ получения фидерных клеток (FC), специально скорректированных для фазы клонирования Т-лимфоцитов, выделенных из интерстициальных клеток клапана. Питательный слой состоит из клеток с остановкой роста, которые все еще жизнеспособны и биологически активны. Роль фидерных клеток важна для поддержания выживания in vitro и роста Т-лимфоцитов, выделенных из интерстициальных клеток ^{клапана23}. Чтобы избежать пролиферации фидерных клеток в культуре, эти клетки должны пройти остановку роста. Это может быть достигнуто двумя способами: с помощью физических методов, таких как облучение, или путем лечения цитотоксическими химическими веществами, такими как митомицин С (MMC), противоопухолевый антибиотик, который может быть нанесен непосредственно на поверхность ^{культуры24}. Здесь мы показываем остановку роста клеток фидера, достигаемую путем облучения клеток.

Этот метод представляет собой эффективный, экономически эффективный способ выделения и характеристики Т-клеток из ткани аортального клапана, способствуя расширению спектра иммунологических методов изучения патофизиологии CAVD.