Neste estudo, descrevemos o processo de isolamento de linfócitos T a partir de amostras frescas de válvulas aórticas calcificadas e as etapas analíticas da clonagem de células T para a caracterização dos subconjuntos leucócitos adaptativos usando a análise de citometria de fluxo.
A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD), um processo ativo da doença que vai desde o espessamento leve da válvula até a calcificação grave, está associada à alta mortalidade, apesar de novas opções terapêuticas como a substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR).
As vias completas que começam com a calcificação da válvula e levam a estenose aórtica grave permanecem apenas parcialmente compreendidas. Ao fornecer uma representação atenta das células válvulas aórticas in vivo, o ensaio de linfócitos T a partir do tecido da válvula estenótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação. Após a excisão cirúrgica, a amostra fresca da válvula aórtica é dissecada em pequenos pedaços e os linfócitos T são cultivados, clonados e analisados por meio de triagem celular ativada de fluorescência (FACS).
O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados também podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os resultados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações nas concentrações de células T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subtipos específicos de células T de interesse. Neste estudo, mostramos o isolamento das células T, realizado em amostras de válvula aórtica calcificada fresca e as etapas de análise de clones de células T usando citometria de fluxo para entender melhor o papel da imunidade adaptativa na fisiopatologia cavd.
A doença da válvula aórtica calcífica (CAVD) é uma das doenças mais comuns da válvula cardíaca, com forte impacto na assistência à saúde. A frequência de substituição da válvula aórtica nos últimos anos aumentou drasticamente e espera-se que aumente ainda mais, devido à crescente população idosa1.
A fisiopatologia subjacente do CAVD é apenas parcialmente conhecida e as estratégias terapêuticas atuais estão limitadas a medidas conservadoras ou substituição da válvula aórtica, seja através de procedimentos cirúrgicos ou percutâneos. Até o momento, nenhum tratamento médico eficaz pode dificultar ou reverter a progressão do CAVD e a alta mortalidade está associada ao início precoce dos sintomas, a menos que seja realizada a substituição da válvula aórtica (AVR). Em pacientes com estenose aórtica aórtica sintomática grave, a sobrevida sem sintomas de 3 anos foi relatada como baixa de 20%3. A substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR) representa uma nova opção, revolucionando o tratamento para pacientes de alto risco, especialmente entre os idosos e reduziu drasticamente a mortalidade, que era intrinsecamente alta nessa população4,5,6. Apesar dos resultados promissores do TAVR, novas pesquisas são necessárias para entender a fisiopatologia CAVD para identificar novos alvos terapêuticos precoces7,8,9.
Antes considerado um processo passivo e degenerativo, o CAVD é agora reconhecido como uma doença progressiva ativa, caracterizada por um interruptor de fenótipo osteoblástico das células intersticiais da válvula aórtica10. Esta doença envolve mineralização progressiva, alterações fibrocalcísicas e redução da motilidade dos folhetos da válvula aórtica (esclerose), que acabam por obstruir o fluxo sanguíneo levando ao estreitamento (estenose) da abertura da válvula aórtica11.
A inflamação é considerada um processo-chave na fisiopatologia CAVD, semelhante ao processo de aterosclerose vascular. A lesão endotelial permite a deposição e o acúmulo de espécies lipídicas, especialmente lipoproteínas oxidadas na válvula aórtica12. Essas lipoproteínas oxidadas provocam uma resposta inflamatória, por serem citotóxica, com a atividade inflamatória levando à mineralização. O papel da imunidade inata e adaptativa no desenvolvimento da CAVD e na progressão da doença foi recentemente destacado13. A ativação e a expansão clonal de subconjuntos específicos de células T de memória foram documentados em pacientes com CAVD e folhetos de válvulas aórticas mineralizados, de modo que os processos inflamatórios são assumidos como envolvidos pelo menos no desenvolvimento do CAVD e, presumivelmente, na progressão da doença também14. De fato, embora as células e macrófagos que apresentem antígenos estejam presentes tanto na válvula saudável quanto na doença, a presença de linfócitos T é indicativa de uma válvula aórtica envelhecida e doente. Este infiltrado linfocítico junto com um aumento na neovascularização e metaplasia são sinais histológicos característicos do CAVD15.
Nós hipótesemos a existência de uma interação entre as células interstices da válvula aórtica e a ativação do sistema imunológico, o que potencialmente desencadeia o início de um processo inflamatório crônico na válvula aórtica. O ensaio das células T a partir do tecido da válvula aórtica estótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação, pois pode fornecer uma representação próxima das células válvulas aórticas in vivo. No presente trabalho, utilizando tecido da válvula aórtica, isolamos linfócitos T, cultura e cloná-los, e posteriormente os caracterizamos usando a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS). Amostras frescas de válvulas aórticas foram excisadas de pacientes cavd que receberam substituição da válvula cirúrgica para estenose aórtica grave. Após a excisão cirúrgica, a amostra de válvula fresca foi dissecada em pequenos pedaços e as células T foram cultivadas, clonadas e então analisadas por citometria de fluxo. O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os dados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações na distribuição de linfócitos T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subconjuntos específicos de células T de interesse.
A extração de tecido calcificado, o isolamento de leucócitos do tecido calcificado e, particularmente, o uso de citometria de fluxo neste tipo de tecido podem ser desafiadores, devido a questões como a autofluorescência. Poucas publicações existem com protocolos para este propósito específico16,17,18. Aqui apresentamos um protocolo projetado especificamente para o isolamento direto e cultura do linfócito T a partir de amostras de válvulas aórticas humanas. A expansão clonal de linfócitos é uma marca registrada da imunidade adaptativa. Estudar esse processo in vitro fornece informações perspicazes sobre o nível de heterogeneidade linfócito19. Após um período de incubação de três semanas, os clones de células T estão prontos para serem explantados, pois uma quantidade adequada de células T de cada clone foi obtida, de modo a permitir o estudo fenotípico e funcional. Posteriormente, o fenótipo dos clones T é estudado por citofluorometria.
Este protocolo imunológico é uma adaptação de um método anteriormente desenvolvido pela Amedei et al. para isolamento celular T e caracterização do tecido humano, especialmente projetado para tecido humano calcificado, como em CAVD20,21,22. O protocolo aqui para o isolamento de PBMCs (células mononucleares de sangue periféricos) usando casaco de buffy irradiado descreve uma maneira eficaz de obter células alimentadoras (FC), especificamente ajustadas para a fase de clonagem de linfócitos T isolados das células intersticiais da válvula. A camada alimentador consiste em células presas em crescimento, que ainda são viáveis e bioativas. O papel das células alimentadoras é importante para apoiar a sobrevivência in vitro e o crescimento de linfócitos T isolados das células intersticiais da válvula23. Para evitar a proliferação de células alimentados na cultura, essas células devem sofrer uma parada de crescimento. Isso pode ser alcançado de duas maneiras: através de métodos físicos como a irradiação, ou através do tratamento com produtos químicos citotóxicos, como a mitomicina C (MMC), um antibiótico antitumoral que pode ser aplicado diretamente à superfície da cultura24. Aqui mostramos a prisão de crescimento celular alimentador alcançada através da irradiação celular.
Este método apresenta uma maneira eficiente e econômica de isolar e caracterizar células T a partir do tecido da válvula aórtica, contribuindo para a ampliação do espectro de métodos imunológicos para a exploração da fisiopatologia CAVD.
Aqui apresentamos um método para caracterizar subpopulações de linfócitos T isoladas de amostras de válvulas aórticas esténticas, utilizando citometria de fluxo. Este método requer o uso de casaco de buffy irradiado para isolar os PBMCs. A frequência de radiação à qual os sacos de casacos buffy devem ser submetidos é 9000 Rad/90 Gray (Gy) e representa um passo crucial para parar a proliferação das células alimentadoras. O papel das células isoladas dos sacos de casacos buffy é agir apenas como células …
The authors have nothing to disclose.
Todos os sacos de casacos polidos usados para este protocolo foram irradiados graças à disponibilidade do Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer e toda a equipe do Departamento de Radiologia de Charité Benjamin Franklin. Bolsista/Mary Roxana Christopher, este trabalho é apoiado por uma bolsa de estudos da Sociedade Cardíaca Alemã (DGK).
50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |