照射されたバフィーコートからのフィーダー細胞を用いたTリンパ球の分離と培養による大動脈弁石灰化の調査

カルシフィック大動脈弁疾患(CAVD)は、医療に大きな影響を与える最も一般的な心臓弁障害の1つです。ここ数年の大動脈弁置換の頻度は劇的に増加しており、高齢者人口の増加によりさらに増加すると予想される¹。

CAVDの基礎となる病態生理学は部分的にしか知られておらず、現在の治療戦略は外科的または経皮的処置を通じて、保守的な措置または大動脈弁置換に限定されている。現在までに、効果的な治療は、大動脈弁置換(AVR)が行われない限り、CAVD進行を妨げたり逆転させたりすることはなく、早期の症状発症に関連する高い死亡率は^2である。重度の症候性大動脈狭窄症の患者では、3年間の症状のない生存率は20%³と報告された。経カテーテル大動脈弁置換術(TAVR)は、特に高齢者の間でリスクの高い患者の治療に革命を起こし、この人口で本質的に高かった死亡率を劇的に減少させた新しい選択肢を表す^4,5,6。TAVRの有望な結果にもかかわらず、CAVD病態生理学を理解して新たな早期治療目標を同定するためには、さらなる研究が必要である^7,8,9.

以前は受動的で変性プロセスであると考えられていたCAVDは、現在、大動脈弁間質細胞¹⁰の骨芽細胞表現型スイッチによって特徴付けられる活性進行性疾患として認識されている。この疾患は、進行性の塩分化、線維性変化および大動脈弁リーフレット(硬化症)の運動性の低下を伴い、最終的には大動脈弁開口部¹¹の狭窄(狭窄)につながる血流を妨げる。

炎症は、血管アテローム性動脈硬化症のプロセスと同様に、CAVD病態生理学における重要なプロセスと考えられている。内皮損傷は、脂質種の沈着および蓄積、特に大動脈弁¹²における酸化リポタンパク質を可能にする。これらの酸化リポタンパク質は、細胞毒性を持ち、炎症性活性が鉱化につながるため、炎症反応を引き起こす。CAVDの発症および疾患進行における先天性免疫および適応免疫の役割が最近強調されている^13.メモリT細胞の特定のサブセットの活性化およびクローン拡張は、CAVDおよびミネラル化大動脈弁リーフレットを有する患者において文書化されており、炎症プロセスは少なくともCAVDの発症およびおそらく同様に疾患進行に関与すると仮定^される。実際、抗原提示細胞とマクロファージは健康で病気の弁の両方に存在するが、Tリンパ球の存在は、老化し、病気の大動脈弁を示す。このリンパ球浸潤は、新血管新生および転移の増加とともに、^CAVD15の特徴的な組織学的徴候である。

大動脈弁間質細胞と免疫系の活性化との相互作用の存在を仮説し、大動脈弁における慢性炎症プロセスの開始を引き起こす可能性がある。ステノスティック大動脈弁組織からのT細胞のアッシングは、生体内の大動脈弁細胞の密接な表現を提供することができるので、石灰化の発達におけるその役割を明確にする効率的な方法である可能性がある。本研究では、大動脈弁組織を用いて、Tリンパ球を単離し、培養し、それらをクローン化し、その後蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてそれらを特徴付ける。新鮮な大動脈弁サンプルは、重度の大動脈狭窄症の外科的弁置換術を受けたCAVD患者から切除された。外科的切除後、新鮮な弁サンプルを小片で解剖し、T細胞を培養し、その後、フローサイトメトリーを用いて分析した。染色手順は簡単で、染色チューブはパラホルムアルデヒドの0.5%を使用して固定し、15日後まで分析することができます。染色パネルから生成されたデータは、介入に関連して時間の経過とともにTリンパ球分布の変化を追跡するために使用することができ、関心のある特定のT細胞サブセットの活性化状態を評価するために容易に開発することができる。

石灰化組織の抽出、石灰化組織からの白血球の単離、特にこのタイプの組織に対するフローサイトメトリーの使用は、自己蛍光などの問題のために困難であり得る。この特定の目的のためのプロトコルを持つ出版物はほとんど存在しません16,17,18。本明細書では、ヒト大動脈弁試料からのTリンパ球の直接単離および培養のために特別に設計されたプロトコルを提示する。リンパ球のクローン拡張は、適応免疫の特徴である。このプロセスをインビトロで研究することは、リンパ球異遺伝子性¹⁹のレベルに関する洞察に満ちた情報を提供する。3週間のインキュベーション期間の後、T細胞クローンは、各クローンから十分な量のT細胞が得られたように、表現型および機能的研究を可能にするように、剥離する準備ができている。続いてTクローンの表現型をサイトフルオロメトリーで研究する。

この免疫学的プロトコルは、ヒト組織からのT細胞の単離および特徴付けのためにAmedeiらによって以前に開発された方法の適応であり、特に^{CAVD20、21,22}のような石灰化ヒト組織のために設計されている。照射されたバフィーコートを用いたPBMC(末梢血単核細胞)の単離のためのプロトコルは、弁間質細胞から分離されたTリンパ球のクローニング段階に特異的に調整されたフィーダー細胞(FC)を得る有効な方法を説明する。フィーダー層は、増殖で構成され、未だに生存可能で生理活性である。フィーダー細胞の役割は、弁間質細胞²³から分離されたTリンパ球のインビトロ生存および増殖を支えるために重要である。培養中のフィーダー細胞増殖を避けるために、これらの細胞は増殖停止を受けなければならない。これは、照射などの物理的方法を通じて、または細胞毒性化学物質(例えば、マイトマイシンC(MMC)、培養表面24に直接適用することができる抗腫瘍性抗生物質による治療を通じて^、2つの方法で達成することができる。ここでは、細胞照射を通じて達成されたフィーダー細胞増殖停止を示す。

この方法は、大動脈弁組織からT細胞を分離し、特徴付ける効率的で費用対効果の高い方法を提示し、CAVD病態生理学を探索するための免疫学的方法のスペクトルを広げることに寄与する。