Studio della calcificazione della valvola aortica tramite isolamento e coltura di linfociti T utilizzando cellule feeder da Buffy Coat irradiato

La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD) è uno dei disturbi valvolari cardiaci più comuni, con un forte impatto sull’assistenza sanitaria. La frequenza di sostituzione della valvola aortica negli ultimi anni è aumentata drasticamente e si prevede che aumenterà ulteriormente, a causa della crescente popolazione ^anziana1.

La fisiopatologia sottostante della CAVD è solo parzialmente nota e le attuali strategie terapeutiche sono limitate a misure conservative o alla sostituzione della valvola aortica, sia attraverso procedure chirurgiche che percutanee. Ad oggi, nessun trattamento medico efficace può ostacolare o invertire la progressione della CAVD e un’elevata mortalità è associata all’insorgenza precoce dei sintomi, a meno che non venga eseguita la sostituzione della valvola aortica (AVR⁾². Nei pazienti con stenosi aortica sintomatica grave, la sopravvivenza libera da sintomi a 3 anni è stata riportata a partire dal 20%³. La sostituzione transcatetere della valvola aortica (TAVR) rappresenta una nuova opzione, rivoluzionando il trattamento per i pazienti ad alto rischio, specialmente tra gli anziani e ha ridotto drasticamente la mortalità, che era intrinsecamente alta in questa ^{popolazione4,5,6}. Nonostante i risultati promettenti della TAVR, sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere la fisiopatologia della CAVD per identificare nuovi bersagli ^{terapeutici precoci7,8,9}.

Precedentemente pensato per essere un processo passivo e degenerativo, la CAVD è ora riconosciuta come una malattia progressiva attiva, caratterizzata da un interruttore fenotipico osteoblastico delle cellule interstiziali della valvola ^aortica10. Questa malattia comporta una progressiva mineralizzazione, cambiamenti fibrocalcifici e una ridotta motilità dei foglietti della valvola aortica (sclerosi), che alla fine ostruiscono il flusso sanguigno portando al restringimento (stenosi) dell’apertura della valvola ^aortica11.

L’infiammazione è considerata un processo chiave nella fisiopatologia CAVD, simile al processo di aterosclerosi vascolare. La lesione endoteliale consente la deposizione e l’accumulo di specie lipidiche, in particolare lipoproteine ossidate nella valvola ^aortica12. Queste lipoproteine ossidate provocano una risposta infiammatoria, in quanto citotossiche, con l’attività infiammatoria che porta alla mineralizzazione. Il ruolo dell’immunità innata e adattativa nello sviluppo della CAVD e nella progressione della malattia è stato recentemente ^{evidenziato13}. L’attivazione e l’espansione clonale di specifici sottoinsiemi di cellule T di memoria sono state documentate in pazienti con CAVD e lembi valvolari aortici mineralizzati, in modo che si presume che i processi infiammatori siano coinvolti almeno nello sviluppo di CAVD e presumibilmente anche nella progressione della ^malattia14. Infatti, sebbene le cellule e i macrofagi che presentano l’antigene siano presenti sia nella valvola sana che in quella malata, la presenza di linfociti T è indicativa di una valvola aortica invecchiata e malata. Questo infiltrato linfocitico insieme ad un aumento della neovascolarizzazione e della metaplasia sono segni istologici caratteristici di ^CAVD15.

Ipotizziamo l’esistenza di un’interazione tra le cellule interstiziali della valvola aortica e l’attivazione del sistema immunitario, che potenzialmente innesca l’avvio di un processo infiammatorio cronico nella valvola aortica. Il dosaggio delle cellule T dal tessuto della valvola aortica stenotica potrebbe essere un modo efficace per chiarire il loro ruolo nello sviluppo della calcificazione, in quanto può fornire una rappresentazione ravvicinata delle cellule della valvola aortica in vivo. Nel presente lavoro, utilizzando il tessuto valvolare aortico, isoliamo i linfociti T, li colturamo e li cloniamo e successivamente li caratterizziamo utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Campioni freschi di valvola aortica sono stati asportati da pazienti con CAVD che hanno ricevuto la sostituzione chirurgica della valvola per stenosi aortica grave. Dopo l’escissione chirurgica, il campione di valvola fresco è stato sezionato in piccoli pezzi e le cellule T sono state coltivate, clonate e poi analizzate utilizzando la citometria a flusso. La procedura di colorazione è semplice e i tubi colorati possono essere fissati utilizzando lo 0,5% di paraformaldeide e analizzati fino a 15 giorni dopo. I dati generati dal pannello di colorazione possono essere utilizzati per tracciare i cambiamenti nella distribuzione dei linfociti T nel tempo in relazione all’intervento e potrebbero essere facilmente ulteriormente sviluppati per valutare gli stati di attivazione di specifici sottoinsiemi di cellule T di interesse.

L’estrazione del tessuto calcificato, l’isolamento dei leucociti dal tessuto calcificato e in particolare l’uso della citometria a flusso su questo tipo di tessuto possono essere impegnativi, a causa di problemi come l’autofluorescenza. Esistono poche pubblicazioni con protocolli per questo scopo specifico16,17,18. Qui presentiamo un protocollo progettato specificamente per l’isolamento diretto e la coltura di linfociti T da campioni di valvola aortica umana. L’espansione clonale dei linfociti è un segno distintivo dell’immunità adattativa. Lo studio di questo processo in vitro fornisce informazioni approfondite sul livello di eterogeneità dei ^linfociti19. Dopo un periodo di incubazione di tre settimane, i cloni di cellule T sono pronti per essere espiantati, in quanto è stata ottenuta una quantità adeguata di cellule T da ciascun clone, in modo da consentire lo studio fenotipico e funzionale. Successivamente il fenotipo dei cloni T viene studiato mediante citofluorometria.

Questo protocollo immunologico è un adattamento di un metodo precedentemente sviluppato da Amedei et al. per l’isolamento e la caratterizzazione delle cellule T da tessuto umano, appositamente progettato per il tessuto umano calcificato, come in CAVD20,21,22. Il protocollo qui per l’isolamento delle PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) utilizzando il buffy coat irradiato descrive un modo efficace per ottenere cellule feeder (FC), specificamente regolate per la fase di clonazione dei linfociti T isolati dalle cellule interstiziali valvolari. Lo strato di alimentazione è costituito da cellule arrestate dalla crescita, che sono ancora vitali e bioattive. Il ruolo delle cellule feeder è importante per supportare la sopravvivenza in vitro e la crescita dei linfociti T isolati dalle cellule interstiziali ^valvolari23. Al fine di evitare la proliferazione delle cellule di alimentazione in coltura, queste cellule devono subire un arresto della crescita. Ciò può essere ottenuto in due modi: attraverso metodi fisici come l’irradiazione o attraverso il trattamento con sostanze chimiche citotossiche, come la mitomicina C (MMC), un antibiotico antitumorale che può essere applicato direttamente sulla superficie di ^coltura24. Qui mostriamo l’arresto della crescita delle cellule di alimentazione ottenuto attraverso l’irradiazione cellulare.

Questo metodo presenta un modo efficiente ed economico per isolare e caratterizzare le cellule T dal tessuto valvolare aortico, contribuendo ad ampliare lo spettro dei metodi immunologici per esplorare la fisiopatologia CAVD.