חקירת הסתיידות שסתום אבי העורקים באמצעות בידוד ותרבות של לימפוציטים T באמצעות תאי מאכיל ממעיל באפי מוקרן
Summary
במחקר זה, אנו מתארים את התהליך של בידוד לימפוציטים T מדגימות טריות של שסתומי אבי העורקים מסוידים ואת השלבים האנליטיים של שיבוט תאי T לאפיון של תת קבוצות לויקוציטים אדפטיביים באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה.
Abstract
מחלת שסתום אבי העורקים מסוידת (CAVD), תהליך מחלה פעיל החל עיבוי קל של השסתום להסתיידות חמורה, קשורה לתמותה גבוהה, למרות אפשרויות טיפוליות חדשות כגון החלפת שסתום אבי העורקים transcatheter (TAVR).
המסלולים המלאים שמתחילים בהסתיידות שסתום ומובילים לה היצרות אבי העורקים חמורה נשארים מובנים רק חלקית. על ידי מתן ייצוג הדוק של תאי שסתום אבי העורקים ב vivo, בדיקת לימפוציטים T מרקמת שסתום סטנוטית יכולה להיות דרך יעילה להבהיר את תפקידם בהתפתחות של הסתיידות. לאחר כריתה כירורגית, דגימת שסתום אבי העורקים הטרי מנותחת בחתיכות קטנות ואת לימפוציטים T הם מתורבתים, משובטים ואז מנותחים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).
הליך הכתמים הוא פשוט ואת צינורות מוכתמים ניתן גם לתקן באמצעות 0.5% של paraformaldehyde וניתח עד 15 ימים מאוחר יותר. התוצאות שנוצרו מלוח הכתמים ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר שינויים בריכוזים תאי T לאורך זמן ביחס להתערבות, יכול בקלות להיות מפותח עוד יותר כדי להעריך מצבי הפעלה של תת סוגים ספציפיים של תא T של עניין. במחקר זה, אנו מראים את הבידוד של תאי T, המבוצע על דגימות שסתום אבי העורקים מסויד טרי ואת השלבים של ניתוח שיבוטים תא T באמצעות cytometry זרימה כדי להבין עוד יותר את התפקיד של חסינות אדפטיבית בפתופיזיולוגיה CAVD.
Introduction
מחלת שסתום אבי העורקים קלציפי (CAVD) היא אחת ההפרעות הנפוצות ביותר שסתום הלב, עם השפעה כבדה על הבריאות. תדירות החלפת שסתום אבי העורקים בשנים האחרונות גדלה באופן דרמטי וצפויה לגדול עוד יותר, בשל הגידול באוכלוסיית הקשישים1.
הפתופיזיולוגיה הבסיסית של CAVD ידועה רק באופן חלקי והאסטרטגיות הטיפוליות הנוכחיות מוגבלות לצעדים שמרניים או להחלפת שסתום אבי העורקים, בין אם באמצעות הליכים כירורגיים או עוריים. עד כה, שום טיפול רפואי יעיל לא יכול לעכב או להפוך התקדמות CAVD ותמותה גבוהה קשורה עם הופעת סימפטום מוקדם, אלא אם כן החלפת שסתום אבי העורקים (AVR) מבוצעת2. בחולים עם היצרות חמורה של כאבי העורקים, הישרדות ללא תסמינים 3 שנים דווח נמוך כמו 20%3. החלפת שסתום אבי העורקים Transcatheter (TAVR) מייצגת אפשרות חדשה, מהפכה בטיפול בחולים בסיכון גבוה, במיוחד בקרב קשישים וצמצמה באופן דרמטי את התמותה, שהייתה גבוהה באופן מהותי באוכלוסייה זו4,5,6. למרות התוצאות המבטיחות של TAVR, דרוש מחקר נוסף כדי להבין פתופיזיולוגיה CAVD כדי לזהות מטרות טיפוליות מוקדמות חדשניות7,8,9.
בעבר נחשב תהליך פסיבי, ניווני, CAVD מוכר כעת כמחלה מתקדמת פעילה, המאופיינת על ידי מתג פנוטיפ osteoblastic של תאים interstitial שסתום אבי העורקים10. מחלה זו כרוכה מינרליזציה מתקדמת, שינויים פיברוקליפיים ותנועתיות מופחתת של עלוני שסתום אבי העורקים (טרשת), אשר בסופו של דבר לחסום את זרימת הדם המובילה היצרות (היצרות) של פתח שסתום אבי העורקים11.
דלקת נחשבת תהליך מפתח בפתופיזיולוגיה CAVD, בדומה לתהליך של טרשת עורקים וסקולרית. פגיעה אנדותל מאפשרת תצהיר והצטברות של מינים שומנים בדם, במיוחד ליפופרוטאינים מחומצנים בשסתום אבי העורקים12. ליפופרוטאינים מחומצנים אלה מעוררים תגובה דלקתית, שכן הם ציטוטוקסיים, עם הפעילות הדלקתית המובילה מינרליזציה. תפקידה של חסינות מולדת ומסתגלת בהתפתחות CAVD והתקדמות המחלה הודגש לאחרונה13. ההפעלה וההרחבה של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T זיכרון תועדו בחולים עם CAVD ועלוני שסתום אבי העורקים מינרליזציה, כך שתהליכים דלקתיים מניחים להיות מעורבים לפחות בפיתוח של CAVD וככל הנראה בהתקדמות המחלה גם כן14. למעשה, למרות תאים אנטיגן מציג מקרופאגים נמצאים הן שסתום בריא ומחלות, נוכחות של לימפוציטים T מעידה על שסתום אבי העורקים מיושן וחולים. לימפוציטים זה לחדור יחד עם עלייה ניאווסקולריזציה מטאפלזיה אופייניים סימנים היסתולוגיים של CAVD15.
אנו משערים את קיומה של אינטראקציה בין תאי ביניים שסתום אבי העורקים ואת ההפעלה של המערכת החיסונית, אשר פוטנציאל מפעיל את תחילתו של תהליך דלקתי כרוני בשסתום אבי העורקים. בדיקת תאי T מרקמת שסתום אבי העורקים stenotic יכולה להיות דרך יעילה להבהיר את תפקידם בהתפתחות הסתיידות, שכן היא יכולה לספק ייצוג הדוק של תאי שסתום אבי העורקים ב vivo. בעבודה הנוכחית, באמצעות רקמת שסתום אבי העורקים, אנו מבודדים לימפוציטים T, תרבות לשכפל אותם, ולאחר מכן לאפיין אותם באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטית (FACS). דגימות שסתום אבי העורקים טריים נכרתו מחולי CAVD שקיבלו החלפת שסתום כירורגי להיפוך אבי העורקים החמור. לאחר כריתת הכירורגיה, דגימת השסתום הטרי נותחה בחתיכות קטנות ותאי ה- T היו בתרבית, שוכפלו ואז נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. הליך הכתם הוא פשוט ואת הצינורות מוכתמים ניתן לתקן באמצעות 0.5% של paraformaldehyde וניתח עד 15 ימים מאוחר יותר. הנתונים שנוצרו מלוח הכתמים יכולים לשמש כדי לעקוב אחר שינויים בהתפלגות לימפוציטים T לאורך זמן ביחס להתערבות, ניתן לפתח בקלות עוד יותר כדי להעריך מצבי הפעלה של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T של עניין.
מיצוי של רקמה מסוידת, בידוד של לויקוציטים מרקמה מסוידת ובמיוחד השימוש בציטומטריית זרימה על סוג זה של רקמה יכול להיות מאתגר, בשל בעיות כגון autofluorescence. פרסומים מעטים קיימים בפרוטוקולים למטרה ספציפית זו16,17,18. כאן אנו מציגים פרוטוקול שתוכנן במיוחד לבידוד ישיר ותרבות של לימפוציט T מדגימות שסתום אבי העורקים האנושי. הרחבת כלין של לימפוציטים היא סימן היכר של חסינות אדפטיבית. לימוד תהליך זה במבחנה מספק מידע תובנה על רמת הטרוגניות הלימפוציטים19. לאחר תקופת דגירה של שלושה שבועות, שיבוטי תאי T מוכנים להסבר, שכן הושגה כמות מספקת של תאי T מכל שיבוט, כדי לאפשר את המחקר הפנוטיפי והתפקודי. לאחר מכן הפנוטיפ של שיבוטי T נחקר על ידי ציטפלואורומטריה.
פרוטוקול אימונולוגי זה הוא התאמה של שיטה שפותחה בעבר על ידי Amedei et al. לבידוד תאי T ואפיון מרקמה אנושית, המיועדת במיוחד לרקמה אנושית מסוידת, כגון CAVD20,21,22. הפרוטוקול כאן לבידוד של PBMCs (תאים מונונוקלאריים בדם היקפי) באמצעות מעיל באפי מוקרן מתאר דרך יעילה להשיג תאי מאכילה (FC), המותאמים במיוחד לשלב השיבוט של לימפוציטים T מבודדים מתאי ביניים שסתום. שכבת המאכיל מורכבת מתאים עצורים בצמיחה, שעדיין הם בני קיימא וביואקטיביים. התפקיד של תאי מאכיל חשוב כדי לתמוך בהישרדות במבחנה וצמיחה של לימפוציטים T מבודדים תאים ביניים שסתום23. על מנת למנוע התפשטות תאי הזנה בתרבית, תאים אלה חייבים לעבור מעצר גדילה. זה יכול להיות מושגת בשתי דרכים: באמצעות שיטות פיזיות כגון הקרנה, או באמצעות טיפול עם כימיקלים ציטוטוקסיים, כגון mitomycin C (MMC), אנטיביוטיקה אנטיטומורלית שניתן ליישם ישירות על פני השטח התרבותיים24. כאן אנו מראים מעצר צמיחה תא מאכיל שהושג באמצעות הקרנת תאים.
שיטה זו מציגה דרך יעילה וחסכונית לבודד ולאפיין תאי T מרקמת שסתום אבי העורקים, התורמת להרחבת הספקטרום של שיטות אימונולוגיות לחקר פתופיזיולוגיה CAVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה לאפיון תת-אוכלוסין של לימפוציטים מסוג T המבודדים מדגימות שסתום אבי העורקים, באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו דורשת שימוש במעיל באפי מוקרן כדי לבודד את מחשבי ה-PBMCs. תדירות הקרינה שאליה יש לחשוף את שקיות המעילים היא 9000 Rad/90 Gray (Gy) והיא מייצגת צעד מכריע לעצירת התפשטות תאי המ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כל שקיות המעילים של באפי ששימשו לפרוטוקול הזה הוקרנו הודות לזמינותם של ד”ר פיטר רוזנטל, ד”ר דירק בהמר וכל הצוות של מחלקת הרדיולוגיה של צ’רייט בנג’מין פרנקלין. בעל מלגה / מרי רוקסנה כריסטופר, עבודה זו נתמכת על ידי מלגה מאגודת הלב הגרמנית (DGK).
Materials
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: “on-label” versus “off-label” use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of “Not Effector” T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ –adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
