Onderzoek naar aortaklepverkalking via isolatie en kweek van T-lymfocyten met behulp van feedercellen van bestraalde buffy coat

Calcific aortaklepziekte (CAVD) is een van de meest voorkomende hartklepaandoeningen, met een zware impact op de gezondheidszorg. De frequentie van aortaklepvervanging is de laatste jaren dramatisch toegenomen en zal naar verwachting verder toenemen, als gevolg van de groeiende oudere ^bevolking1.

De onderliggende pathofysiologie van CAVD is slechts gedeeltelijk bekend en de huidige therapeutische strategieën zijn beperkt tot conservatieve maatregelen of aortaklepvervanging, hetzij door chirurgische of percutane procedures. Tot op heden kan geen enkele effectieve medische behandeling de progressie van CAVD belemmeren of omkeren en is hoge mortaliteit geassocieerd met vroege symptoom-aanvang, tenzij aortaklepvervanging (AVR) wordt ^uitgevoerd2. Bij patiënten met ernstige symptomatische aortastenose werd de 3-jaars symptoomvrije overleving gerapporteerd zo laag als 20%³. Transkatheter aortaklepvervanging (TAVR) vertegenwoordigt een nieuwe optie, die een revolutie teweegbrengt in de behandeling van patiënten met een hoog risico, vooral bij ouderen, en heeft de mortaliteit, die intrinsiek hoog was in deze populatie^{, drastisch verminderd4,5,6}. Ondanks de veelbelovende resultaten van TAVR is verder onderzoek nodig om de PATHOfysiologie van CAVD te begrijpen om nieuwe vroege therapeutische doelen te ^{identificeren7,8,9}.

Eerder gedacht dat het een passief, degeneratief proces was, wordt CAVD nu erkend als een actieve progressieve ziekte, gekenmerkt door een osteoblastische fenotypeschakelaar van de interstitiële cellen van de aortaklep10. Deze ziekte omvat progressieve mineralisatie, fibrocalcische veranderingen en verminderde beweeglijkheid van de aortaklepblaadjes (sclerose), die uiteindelijk de bloedstroom belemmeren, wat leidt tot vernauwing (stenose) van de aortaklepopening11.

Ontsteking wordt beschouwd als een belangrijk proces in cavd pathofysiologie, vergelijkbaar met het proces van vasculaire atherosclerose. Endotheelbeschadiging maakt de afzetting en accumulatie van lipidesoorten mogelijk, met name geoxideerde lipoproteïnen in de ^aortaklep12. Deze geoxideerde lipoproteïnen veroorzaken een ontstekingsreactie, omdat ze cytotoxisch zijn, waarbij de ontstekingsactiviteit leidt tot mineralisatie. De rol van aangeboren en adaptieve immuniteit in de ontwikkeling van CAVD en ziekteprogressie is onlangs ^benadrukt13. De activering en klonale expansie van specifieke subsets van geheugen T-cellen zijn gedocumenteerd bij patiënten met CAVD en gemineraliseerde aortaklepblaadjes, zodat ontstekingsprocessen worden verondersteld op zijn minst betrokken te zijn bij de ontwikkeling van CAVD en vermoedelijk ook bij ^{ziekteprogressie14}. Hoewel antigeen-presenterende cellen en macrofagen aanwezig zijn in zowel de gezonde als de zieke klep, is de aanwezigheid van T-lymfocyten indicatief voor een verouderde en zieke aortaklep. Dit lymfocytische infiltraat samen met een toename van neovascularisatie en metaplasie zijn karakteristieke histologische tekenen van ^CAVD15.

We veronderstellen het bestaan van een interactie tussen de interstitiële cellen van de aortaklep en de activering van het immuunsysteem, wat mogelijk de initiatie van een chronisch ontstekingsproces in de aortaklep veroorzaakt. Het testen van T-cellen uit stenotisch aortaklepweefsel zou een efficiënte manier kunnen zijn om hun rol in de ontwikkeling van verkalking te verduidelijken, omdat het een nauwe weergave van de aortaklepcellen in vivo kan bieden. In het huidige werk, met behulp van aortaklepweefsel, isoleren we T-lymfocyten, kweken en klonen ze, en karakteriseren ze vervolgens met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Verse aortaklepmonsters werden weggesneden van CAVD-patiënten die chirurgische klepvervanging kregen voor ernstige aortastenose. Na de chirurgische excisie werd het verse klepmonster in kleine stukjes ontleed en werden de T-cellen gekweekt, gekloond en vervolgens geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. De kleuringsprocedure is eenvoudig en de gekleurde buizen kunnen worden bevestigd met 0,5% paraformaldehyde en tot 15 dagen later worden geanalyseerd. De gegevens die door het kleuringspaneel worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om veranderingen in de distributie van T-lymfocyten in de loop van de tijd in relatie tot interventie te volgen en kunnen gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activeringstoestanden van specifieke T-celsubsets van belang te beoordelen.

De extractie van verkalkt weefsel, de isolatie van leukocyten uit verkalkt weefsel en met name het gebruik van flowcytometrie op dit type weefsel kan een uitdaging zijn, vanwege problemen zoals autofluorescentie. Er bestaan weinig publicaties met protocollen voor dit specifieke doel16,17,18. Hierin presenteren we een protocol dat speciaal is ontworpen voor de directe isolatie en kweek van T-lymfocyten uit menselijke aortaklepmonsters. Klonale expansie van lymfocyten is een kenmerk van adaptieve immuniteit. Het bestuderen van dit proces in vitro levert inzichtelijke informatie op over het niveau van lymfocyten ^{heterogeniteit19}. Na een incubatietijd van drie weken zijn de T-celklonen klaar om te worden geëxplanteerd, omdat een voldoende hoeveelheid T-cellen van elke kloon werd verkregen, om de fenotypische en functionele studie mogelijk te maken. Vervolgens wordt het fenotype van T-klonen bestudeerd door cytofluorometrie.

Dit immunologische protocol is een aanpassing van een eerder door Amedei et al. ontwikkelde methode voor T-celisolatie en karakterisering uit menselijk weefsel, speciaal ontworpen voor verkalkt menselijk weefsel, zoals in CAVD20,21,22. Het protocol hier voor de isolatie van PBMC’s (perifere bloedmononucleaire cellen) met behulp van bestraalde buffy coat beschrijft een effectieve manier om feedercellen (FC) te verkrijgen, specifiek aangepast voor de kloonfase van T-lymfocyten geïsoleerd uit klepinterstitiële cellen. De feederlaag bestaat uit in groei gestopte cellen, die nog levensvatbaar en bioactief zijn. De rol van feedercellen is belangrijk ter ondersteuning van in vitro overleving en groei van T-lymfocyten geïsoleerd uit klepinterstitiële ^cellen23. Om feedercelproliferatie in cultuur te voorkomen, moeten deze cellen een groeistop ondergaan. Dit kan op twee manieren worden bereikt: door fysische methoden zoals bestraling, of door behandeling met cytotoxische chemicaliën, zoals mitomycine C (MMC), een antitumoraal antibioticum dat rechtstreeks op het kweekoppervlak kan worden ^{aangebracht24}. Hier laten we zien dat de groei van de feedercel wordt gestopt door celbestraling.

Deze methode biedt een efficiënte, kosteneffectieve manier om T-cellen uit aortaklepweefsel te isoleren en te karakteriseren, wat bijdraagt aan het verbreden van het spectrum van immunologische methoden voor het verkennen van CAVD-pathofysiologie.