التحقيق في تكلس الصمام الأبهري عن طريق العزلة وثقافة الخلايا الليمفاوية T باستخدام الخلايا المغذية من معطف بافي المشعع
Summary
في هذه الدراسة، ونحن نصف عملية عزل الخلايا الليمفاوية T من عينات جديدة من الصمامات الأبهري المتكلسة والخطوات التحليلية لاستنساخ الخلايا التائية لتوصيف المجموعات الفرعية الكريات البيض التكيفية باستخدام تحليل تدفق قياس الخلايا.
Abstract
يرتبط مرض الصمام الأبهري الكالسيومي (CAVD)، وهو عملية مرض نشطة تتراوح بين سماكة خفيفة للصمام إلى تكلس شديد، بارتفاع معدل الوفيات، على الرغم من الخيارات العلاجية الجديدة مثل استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة (TAVR).
المسارات الكاملة التي تبدأ مع تكلس الصمام وتؤدي إلى تضيق الأبهر الشديد لا تزال مفهومة جزئيا فقط. من خلال توفير تمثيل وثيق لخلايا الصمام الأبهري في الجسم الحي ، يمكن أن يكون فحص الخلايا الليمفاوية T من أنسجة الصمام الشهوتي طريقة فعالة لتوضيح دورها في تطوير التكلس. بعد الختان الجراحي ، يتم تشريح عينة الصمام الأبهري الطازجة في قطع صغيرة ويتم استزراع الخلايا الليمفاوية T ، واستنساخها ثم تحليلها باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS).
إجراء تلطيخ بسيط ويمكن أيضا أن تكون ثابتة أنابيب ملطخة باستخدام 0.5٪ من paraformaldehyde وتحليلها حتى 15 يوما في وقت لاحق. ويمكن استخدام النتائج الناتجة عن لوحة تلطيخ لتتبع التغيرات في تركيزات الخلايا التائية مع مرور الوقت فيما يتعلق بالتدخل ويمكن بسهولة مواصلة تطويرها لتقييم حالات التنشيط للأنواع الفرعية المحددة من الخلايا التائية ذات الاهتمام. في هذه الدراسة، نظهر عزلة الخلايا التائية، التي أجريت على عينات الصمام الأبهري المتكلسة الطازجة وخطوات تحليل استنساخ الخلايا التائية باستخدام قياس التدفق الخلوي لزيادة فهم دور المناعة التكيفية في الفيزيولوجيا المرضية CAVD.
Introduction
مرض الصمام الأبهري الكالسيومي (CAVD) هو واحد من أكثر اضطرابات صمام القلب شيوعا ، مع تأثير كبير على الرعاية الصحية. ازدادت وتيرة استبدال الصمام الأبهري في السنوات الأخيرة بشكل كبير ومن المتوقع أن تزيد أكثر، بسبب تزايد عدد السكان المسنين1.
الفيزيولوجيا المرضية الأساسية من CAVD معروفة جزئيا فقط وتقتصر الاستراتيجيات العلاجية الحالية على التدابير المحافظة أو استبدال الصمام الأبهري ، إما من خلال الإجراءات الجراحية أو عن طريق الجلد. حتى الآن، لا يمكن لأي علاج طبي فعال أن يعيق أو يعكس تطور CAVD ويرتبط ارتفاع معدل الوفيات بظهور الأعراض المبكر، ما لم يتم إجراء استبدال الصمام الأبهري (AVR)2. في المرضى الذين يعانون من تضيق الأبهر أعراض حادة، تم الإبلاغ عن البقاء على قيد الحياة خالية من الأعراض لمدة 3 سنوات منخفضة حتى 20٪3. يمثل استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة (TAVR) خيارا جديدا ، مما أحدث ثورة في علاج المرضى المعرضين لخطر كبير ، خاصة بين كبار السن ، وخفض بشكل كبير معدل الوفيات ، الذي كان مرتفعا في جوهره في هذه الفئة من السكان 4،5،6. على الرغم من النتائج الواعدة ل TAVR ، من الضروري إجراء مزيد من الأبحاث لفهم الفيزيولوجيا المرضية CAVD لتحديد الأهداف العلاجية المبكرة الجديدة7،8،9.
كان يعتقد سابقا أن تكون سلبية, عملية التنكسية, ومن المسلم به الآن CAVD كمرض التقدمية النشطة, تتميز التبديل الظاهري العظمي من الخلايا الخلالية الصمام الأبهري10. هذا المرض ينطوي على التمعدن التدريجي، والتغيرات الليفية وانخفاض حركية منشورات الصمام الأبهري (التصلب)، والتي تعوق في نهاية المطاف تدفق الدم مما يؤدي إلى تضييق (تضيق) من فتح الصمام الأبهري11.
يعتبر الالتهاب عملية رئيسية في الفيزيولوجيا المرضية CAVD ، على غرار عملية تصلب الشرايين الوعائية. إصابة البطانية تمكن من ترسب وتراكم أنواع الدهون، وخاصة البروتينات الدهنية المؤأكسدة في الصمام الأبهري12. تثير هذه البروتينات الدهنية المؤأكسدة استجابة التهابية ، لأنها سامة للخلايا ، مع النشاط الالتهابي الذي يؤدي إلى التمعدن. وقد تم مؤخرا تسليط الضوء على دور المناعة الفطرية والتكيفية في تطوير CAVD وتطور المرض13. تم توثيق تنشيط وتوسع التخفي من مجموعات فرعية محددة من خلايا الذاكرة T في المرضى الذين يعانون من CAVD ومنشورات الصمام الأبهري المعدنية ، بحيث يفترض أن العمليات الالتهابية تشارك على الأقل في تطوير CAVD ويفترض في تطور المرض كذلك 14. في الواقع ، على الرغم من وجود خلايا عرض المستضدات والكواعم في كل من الصمام الصحي والمرض ، فإن وجود الخلايا الليمفاوية T يدل على صمام الأبهر المسن والمرض. هذا التسلل اللمفاوي جنبا إلى جنب مع زيادة في الأوعية الدموية الجديدة و metaplasia هي علامات النسيجية المميزة من CAVD15.
نحن نفترض وجود تفاعل بين الخلايا الخلالية الصمام الأبهري وتنشيط الجهاز المناعي، مما قد يؤدي إلى بدء عملية التهابية مزمنة في الصمام الأبهري. يمكن أن يكون فحص الخلايا التائية من أنسجة الصمام الأبهري النتنة طريقة فعالة لتوضيح دورها في تطوير التكلس ، حيث يمكن أن يوفر تمثيلا وثيقا لخلايا الصمام الأبهري في الجسم الحي. في العمل الحالي ، باستخدام أنسجة الصمام الأبهري ، نعزل الخلايا الليمفاوية التائية ، والثقافة واستنساخها ، ونقوم بعد ذلك بتصنيفها باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS). تم استئصال عينات الصمام الأبهري الطازجة من مرضى CAVD الذين تلقوا استبدال الصمام الجراحي للتوضيق الأبهري الشديد. بعد استئصال الجراحية، تم تشريح عينة صمام جديد في قطع صغيرة وزراعة الخلايا التائية، استنساخ ثم تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. إجراء تلطيخ بسيط ويمكن إصلاح الأنابيب الملطخة باستخدام 0.5٪ من البارافورمالديهايد وتحليلها حتى 15 يوما في وقت لاحق. يمكن استخدام البيانات الناتجة من لوحة التلطيخ لتتبع التغيرات في توزيع الخلايا الليمفاوية T بمرور الوقت فيما يتعلق بالتدخل ويمكن تطويرها بسهولة لتقييم حالات التنشيط للمجموعات الفرعية المحددة من الخلايا التائية ذات الاهتمام.
يمكن أن يكون استخراج الأنسجة المتكلسة وعزل الكريات البيض عن الأنسجة المتكلسة وخاصة استخدام قياس التدفق الخلوي على هذا النوع من الأنسجة أمرا صعبا ، بسبب مشكلات مثل الفلورة الذاتية. ولا توجد سوى منشورات قليلة مع بروتوكولات لهذا الغرض المحدد16,17,18. هنا نقدم بروتوكول مصمم خصيصا لعزل مباشرة والثقافة من الخلايا الليمفاوية T من عينات الصمام الأبهري البشري. التوسع الكلوني للخلايا الليمفاوية هو السمة المميزة للحصانة التكيفية. دراسة هذه العملية في المختبر يوفر معلومات ثاقبة على مستوى التغايرية الخلايا الليمفاوية19. وبعد فترة حضانة مدتها ثلاثة أسابيع، أصبحت استنساخات الخلايا التائية جاهزة للتنضح، حيث تم الحصول على كمية كافية من الخلايا التائية من كل استنساخ، وذلك للسماح بإجراء دراسة فينوتبيك ووظيفية. في وقت لاحق يتم دراسة النمط الظاهري من استنساخ تي عن طريق قياس الخلايا.
هذا البروتوكول المناعي هو تكييف لطريقة سبق أن طورتها أميدي وآخرون لعزل الخلايا التائية وتوصيفها من الأنسجة البشرية ، والمصممة خصيصا للأنسجة البشرية المتكلسة ، كما هو الحال في CAVD20،21،22. البروتوكول هنا لعزل PBMCs (خلايا الدم المحيطية أحادية النووية) باستخدام معطف برتقالي مشع يصف طريقة فعالة للحصول على الخلايا المغذية (FC)، تعديلها خصيصا لمرحلة استنساخ الخلايا الليمفاوية T معزولة عن الخلايا الخلالية صمام. تتكون الطبقة المغذية من الخلايا الموقوفة للنمو ، والتي لا تزال قابلة للحياة وحيوية. دور الخلايا المغذية مهم لدعم البقاء على قيد الحياة في المختبر ونمو الخلايا الليمفاوية T معزولة عن الخلايا الخلالية صمام23. من أجل تجنب انتشار الخلايا المغذية في الثقافة، يجب أن تخضع هذه الخلايا لوقف النمو. ويمكن تحقيق ذلك بطريقتين: من خلال الطرق الفيزيائية مثل التشعيع، أو من خلال العلاج بالمواد الكيميائية السامة للخلايا، مثل الميتوميسين C (MMC)، وهو مضاد حيوي مضاد للورم يمكن تطبيقه مباشرة على سطح الثقافة24. هنا نظهر تغذية خلية النمو اعتقال يتحقق من خلال تشعيع الخلية.
تقدم هذه الطريقة طريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لعزل وتوصيف الخلايا التائية من أنسجة الصمام الأبهري ، مما يساهم في توسيع نطاق الطرق المناعية لاستكشاف الفيزيولوجيا المرضية CAVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم طريقة لتوصيف الخلايا الليمفاوية T الخلايا الفرعية معزولة عن عينات الصمام الأبهري النتنة، وذلك باستخدام قياس التدفق الخلوي. تتطلب هذه الطريقة استخدام معطف برتقالي مشع لعزل PBMCs. تردد الإشعاع الذي يجب أن تتعرض أكياس معطف بافي هو 9000 راد /90 غراي (Gy) ويمثل خطوة حاسمة لوقف انتشار الخلايا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تشعيع جميع أكياس معطف بافي المستخدمة لهذا البروتوكول بفضل توافر الدكتور بيتر روزنتال والدكتور ديرك بومر والفريق بأكمله من قسم الأشعة في شاريتيه بنجامين فرانكلين. حامل المنحة / ماري روكسانا كريستوفر ، ويدعم هذا العمل من خلال منحة دراسية من الجمعية الألمانية للقلب (DGK).
Materials
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: “on-label” versus “off-label” use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of “Not Effector” T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ –adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
