Akustik Levitasyon Sisteminde Küresel Olmayan Kabarcık Salınımları ile Mikroakışın İndüksiyonu

Tıpta, uygulanan bir ilaç, istenen hedeflere ulaşmadan önce canlı sistemdeki birçok engele nüfuz etmelidir. Bununla birlikte, çoğu ilaç hızla kan dolaşımından uzaklaştırılır. Hedefleme etkinliği düşüktür ve hücre zarlarını kolayca geçemezler, bu da etkisiz ilaç dağıtımına yol açar. Günümüzde, ultrason ile kombinasyon halinde mikrokabarcıkların kullanımı, ilaçların ve genlerin patolojik dokulara ve hücrelere invaziv olmayan, kesin ve hedefe yönelik olarak verilmesi için yenilikçi bir yöntem olarak önerilmiştir¹. Bu yaklaşımda, mikro kabarcıklar, serbest ilaçların bir gaz kabarcığı süspansiyonu ile birlikte enjekte edildiği veya yüzeyine yüklendiği taşıyıcılar olarak rol oynayabilir. Mikrokabarcıklar ayrıca hücrelerle etkileşime girmek için ultrason enerjisini yeniden odaklamak için yerel bir vektör görevi görebilir. Temel olarak, ultrasona maruz kalma altında, kabarcıklar kararlı bir şekilde sıkıştırır ve genişler, sıvı akışları üreten ve dolayısıyla yakındaki nesneler üzerinde kayma stresi oluşturan kararlı kavitasyon adı verilen bir rejim. Mikrokabarcıklar ayrıca doğrusal olmayan bir şekilde salınım yapabilir ve atalet kavitasyonu rejiminde çökene kadar genişleyebilir ve çökme bölgesinden^radyal olarak yayılan şok dalgaları üretebilir 2. Stabil veya atalet halindeki kavitasyonun, hücre zarlarının geçirgenliğini arttırdığı ve böylece ilaçların hücre içine içselleştirilmesini arttırdığı gösterilmiştir³.

Terapötik uygulamalarda, kabarcık-hücre etkileşiminin mekanizmasını anlamak çok önemlidir, ancak hem bilimsel hem de teknik açıdan, bilgimizin ilerlemesini engelleyen çeşitli engeller vardır. İlk olarak, kabarcık kaynaklı mekanik uyaranlara yanıt olarak hücrelerin dinamiklerini yakalamak çok zordur⁴. Akustik zaman ölçeğinde, birinci dereceden mikrokabarcık salınımları, membran kanallarının aktivasyonuna yol açarak biyolojik arayüzler arasında moleküler geçişi kolaylaştırabilir. Bu, “hücresel masaj”5 olarak da adlandırılan hücre zarının doğrudan salınımı yoluyla ^{gerçekleşir.} Doğrudan mekanik stresi takiben kanal aktivasyonu, ultrason maruziyeti sırasında ve sonrasında hücre zarlarının elektrofizyolojik özelliklerini ölçen yama-kelepçe teknikleri kullanılarak kanıtlanmıştır⁶. Kabarcık kaynaklı hücre dinamiklerini (hücre zarının deformasyonunun tam alanı anlamına gelir) akustik zaman ölçeğinde ölçmek, gözenekleri hücre zarına indüklemek için gereken membran alanı genişlemesi ΔA / A eşiğinde de içgörüler sağlayacaktır⁷. İkinci bariyer, mikro kabarcık kaynaklı hücre lizizini önlemek için çöken kabarcık rejimini kontrol etmektir. Kabarcık çökmeleri ve indüklenen mikrojetler, membran perforasyonunun meydana geldiği bir mekanizma olarak tanımlanmıştır ^8,9. Geçirgen hale getirildikten sonra, hücre zarı, lipit çift katmanlarının kalsiyumun kendi kendine sızdırmazlığı ve hücre içi veziküllerin füzyonu yoluyla onarılır⁹. Kabarcık çökmelerinin meydana gelmesi de hücrede ölümcül hasarlara neden olabilir ve çevredekilerde gereksiz yan etkilere neden olabilir. Ultrason aracılı kan-beyin bariyeri açılması gibi hassas uygulamalarda atalet kabarcığı çökmelerinden kaçınılması gerektiği genel kabul görmektedir¹⁰.

Bu nedenle, mikrokabarcıkların kararlı salınımlarını sağlamak için pasif kavitasyon izleme ve kontrolü ile birlikte ultrason emisyon dizilerinin tasarımına büyük çabalar harcanmaktadır¹¹. Bu kararlı rejimde, kararlı bir şekilde salınan kabarcıkların, hücre zarı⁷ üzerinde uzamsal olarak hedeflenmiş kayma stresini teşvik ederek membran geçirgenliğinin tetiklenmesinde güçlü bir rol oynadığı varsayılmıştır. Kayma gerilmesi, salınımlı kabarcıkların yakınında oluşturulan sıvı akışlarından kaynaklanır. Bu sıvı akışlarına kavitasyon mikro akışı denir ve yukarıda belirtildiği gibi, hücre dışı moleküllerin gelişmiş alımından sorumlu olan birkaç olası mekanizmadan biridir. Kabarcıkların veya hücrelerin in-vitro biyolojik transfeksiyon tahlilleri¹² gibi süspansiyonu ile uğraşırken, mikro akış ile geçirgenlik, kabarcık çökmesi ile geçirgenlikten çok daha verimli olabilir. Bu, basit bir geometrik düşünceyle gösterilebilir. Hücre süspansiyonlarında, asılı hücrelerin çoğunluğu yeterince büyük mekanik etkilere (membran geçirgenliğine yol açan) gönderilirse sonoporasyon etkili olacaktır. Kabarcık çökmelerinin, kabarcık duvar ekseni¹³ veya kütle¹⁴ merkezlerini birleştiren kabarcık-kabarcık ve kabarcık-hücre çizgisi gibi izotropik simetri kırılma yönü boyunca yönlendirildiği bilinmektedir. Bu nedenle üretilen mikrojet, hücre ve kabarcık merkezlerine katılan sonlu sayıda çizgi boyunca mekansal olarak lokalize bir fenomendir. Hücre ve kabarcık konsantrasyonuna ve ayrıca kabarcık-hücre mesafesine bağlı olarak, bu etki asılı hücrelerin tam sayısını geçirgenleştirmek için en etkili olmayabilir. Buna karşılık, kavitasyon mikro akışı, kabarcık yarıçapına kıyasla büyük bir uzamsal genişleme ile yavaş bir zaman ölçeğinde meydana gelen bir fenomendir. Ayrıca, sıvı akışı kabarcığın her tarafına dağılır ve bu nedenle çok uzun bir aralıkta daha fazla sayıda hücreyi etkileyebilir. Bu nedenle, salınımlı bir kabarcık etrafında üretilen kavitasyon mikroakışını anlamak, hücrelere uygulanan kabarcık kaynaklı kesme stresini kontrol etmek ve ölçmek için bir ön koşuldur.

Bunu yapmak için, bir ön adım, ultrason tahrikli bir kabarcığın küresel ve küresel olmayan salınımlarını kontrol etmekten ibarettir, çünkü üretilen sıvı akışları kabarcık arayüzünün hareketi ile indüklenir^15,16. Özellikle, mikro kabarcıkların şekil salınımları tetiklenmeli ve sabit tutulmalıdır. Ayrıca, kabarcık arayüzü dinamikleri ile indüklenen mikro akış paterni arasındaki korelasyonu doğru bir şekilde analiz etmek için kabarcık şekli salınımlarının oryantasyonu kontrol edilmelidir. Mevcut literatürü özetlerken, kavitasyona bağlı mikro akışın ayrıntılı deneysel sonuçlarının yalnızca bir yüzeye bağlı kabarcıklar için mevcut olduğu açıktır. Duvara bağlı mikro kabarcıklar, ultra hızlı bir mikroskopi sistemi altında mikrometre ölçeğinde doğru arayüz dinamiklerini ve hücre etkileşimlerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Bu konfigürasyon, hücre zarı^17,18,19 üzerinde bulunan titreşimli mikrokabarcıklar göz önüne alındığında terapötik olarak önemlidir. Bununla birlikte, substrata bağlı kabarcığın incelenmesi, kısmen temas hattı dinamiği^20’nin karmaşık doğası ve asimetrik şekil modlarının tetiklenmesi nedeniyle kabarcık dinamiklerinin analizini daha karmaşık hale getirebilir²¹. Tıbbi ve biyolojik uygulamalarda, bir duvara tutturulmamış kabarcıklar genellikle küçük kaplar gibi sınırlı geometrilerde bulunur. Bu, kabarcık dinamiklerini ve şekil dengesizliklerini önemli ölçüde etkiler. Özellikle, yakındaki bir duvarın varlığı, şekil modu için basınç eşiğini kaydırır ve şekil modu numarasına ve kabarcık boyutu^22’ye bağlı olarak basınç değerlerini düşürmek için tetiklenir. Duvar ayrıca, üretilen akış²³ için muhtemelen daha yüksek yoğunlukta kabarcık kaynaklı mikro akışı da etkiler.

Mikro kabarcıkların yaşayabileceği tüm olası senaryolar arasında (serbest veya bağlı, bir duvara yakın, çöken veya istikrarlı bir şekilde salınımlı), herhangi bir sınırdan uzak tek bir kabarcığın küresel olmayan dinamiklerini araştırmayı öneriyoruz. Deneysel kurulum, kabarcığı yakalamak için ayakta duran bir ultrason dalgasının kullanıldığı akustik bir kaldırma sistemi^24’e dayanmaktadır. Bu senaryo, örneğin bir sonotransfeksiyon odasında asılı kabarcıklar ve hücreler koleksiyonunun bir arada bulunduğu tıbbi uygulamalarla tutarlıdır. Kabarcıklar ve hücreler çok yakın olmadığı sürece, bir hücrenin varlığının kabarcık arayüz dinamiklerini etkilemediği varsayılmaktadır. Hücreler kavitasyona bağlı mikro akışın döngü benzeri yörüngelerini takip ettiklerinde, döngüsel olarak kabarcık konumundan yaklaşır ve itilirler ve hücre varlığının ne akış modelini ne de ortalama hızını etkilemediğini varsayabiliriz. Ek olarak, küresel olmayan dinamikler ve sınırdan uzak tek kabarcıklardan indüklenen mikro akış, teorik bir bakış açısıyla iyi bilinmektedir. Kabarcık kaynaklı sıvı akışını kabarcık kontur dinamiklerine bağlamak için, kabarcık arayüz dinamiklerini doğru bir şekilde karakterize etmek gerekir. Bunu yapmak için, deneysel çalışmalarda mekansal zamansal ölçeğin terapötiklerde kullanılanlara göre uyarlanması tercih edilir, böylece ortak yüksek hızlı kameralarla (1 milyon kare / saniyenin altında) elde etmek, daha düşük frekanslarda uyarılan büyük kabarcıklar kullanılarak elde edilebilir. Kaplanmamış kabarcıklar göz önüne alındığında, belirli bir n modunun özfrekansı ω_n, ^{kabarcık boyutu ile 25} olarak ilişkilidir. Bu yarıçap-özfrekans ilişkisi, kabuklu kabarcıklar²⁶ göz önüne alındığında biraz değiştirilir, ancak özfrekans ω_n’nin büyüklük sırası aynı kalır. Bu nedenle, 30 kHz’lik bir ultrason alanında denge yarıçapı ~ 50μm olan kabarcıkların araştırılması, Dollet ve ^ark.27 tarafından önerildiği gibi, 1.7 MHz’lik bir alanda ~ 3μm yarıçaplı kaplanmış kabarcıkları incelemeye benzer. Bu nedenle benzer şekil modu numaraları ve dolayısıyla mikro akış desenleri beklenir.

Kabarcık arayüzünün küresel olmayan salınımlarını tetiklemek için, Şekil 1’de gösterildiği gibi, yarıçapa bağlı belirli bir basınç eşiğini aşmak gerekir. Mevcut deneysel teknikler, yüzey modlarını tetiklemek için akustik basıncın artışına dayanır (Şekil 1’de yol ( 1) ile gösterilmiştir), ya adım adım basınç artışı²⁸ ya da yüzey modlarının periyodik başlangıcından ve yok olmasından sorumlu modüle edilmiş genlik uyarımı^{ile 29}. Bu tekniklerin başlıca dezavantajları, (i) görüntüleme düzleminde olması kontrol edilemeyen yüzey salınımlarının simetri ekseninin rastgele yönlendirilmesi, (ii) indüklenen sıvı akışlarının analizini daha büyük zaman ölçeklerinde zorlaştıran kabarcık şekli salınımlarının kısa bir ömrü ve (iii) kararsız şekil modlarının sık sık tetiklenmesidir. Şekil 1’deki yol (2) ile gösterildiği gibi, yarıçap / basınç haritasındaki sabit bir akustik basınçta basınç eşiğini geçmek için alternatif bir teknik öneriyoruz. Bunu yapmak için, kabarcık boyutunu kararsızlık bölgesinde olacak şekilde artırmak gerekir. Böyle bir artış, bir kabarcık birleştirme tekniği ile gerçekleştirilir. Başlangıçta küresel olarak salınım yapan iki mikro kabarcığın birleşmesi, tek bir deforme olmuş kabarcık oluşturmak için kullanılır. Birleştirilmiş kabarcığın akustik basıncı ve kabarcık boyutu kararsızlık bölgesindeyse, yüzey modları tetiklenir. Ayrıca, birleşme tekniğinin, kararlı bir durum rejiminde kararlı şekil salınımlarına ve ayrıca yaklaşan iki kabarcığın doğrusal hareketi ile tanımlanan kontrollü bir simetri eksenine neden olduğunu kanıtladık. Dakikalar içinde kararlı bir şekil salınımı sağlandığından, kabarcık kaynaklı sıvı akışının analizi, sıvı ortamın ince bir lazer tabakası ile aydınlatılan floresan mikropartiküllerle tohumlanmasıyla mümkündür. Kabarcık arayüzünün yakınındaki katı mikropartiküllerin hareketinin kaydedilmesi, indüklenen sıvı akışının³⁰ modelinin tanımlanmasını sağlar. Zamana dayanıklı bir sıvı akışına yol açan kabarcık şekli salınımlarının tetiklenmesinin genel prensibi Şekil 2’de gösterilmiştir.

Aşağıdaki protokolde, birleştirme tekniği ile kararlı kabarcık şekli salınımları oluşturmak için gereken adımları özetliyoruz ve sıvı akışının ölçümlerini açıklıyoruz. Bu, akustik kaldırma sisteminin tasarımını, akustik kalibrasyonu, kabarcık çekirdeklenmesini ve birleştirme tekniğini, kabarcık arayüz dinamiklerinin ve çevresindeki sıvı akışının ölçülmesini ve görüntü işlemeyi içerir.