Индукция микропотоков несферическими пузырьковыми колебаниями в системе акустической левитации

В медицине вводимое лекарство должно преодолеть множество препятствий в живой системе, прежде чем достичь желаемых целей. Тем не менее, большинство лекарств быстро выводятся из кровотока. Эффективность таргетирования низкая, и они не могут легко пересекать клеточные мембраны, что приводит к неэффективной доставке лекарств. В настоящее время использование микропузырьков в сочетании с ультразвуком предложено в качестве инновационного метода неинвазивной, точной и целенаправленной доставки лекарственных препаратов и генов к патологическим тканям и клеткам¹. В этом подходе микропузырьки могут играть роль носителей, когда свободные лекарства либо вводятся вместе с суспензией газовых пузырьков, либо загружаются на ее поверхность. Микропузырьки также могут выступать в качестве локального вектора для перефокусировки ультразвуковой энергии для взаимодействия с клетками. По сути, под ультразвуковым воздействием пузырьки стабильно сжимаются и расширяются, режим, называемый стабильной кавитацией, который генерирует потоки жидкости и, следовательно, напряжение сдвига на близлежащих объектах. Микропузырьки также могут колебаться нелинейно и расширяться до коллапса в режиме инерционной кавитации, создавая ударные волны, которые распространяются радиально от места коллапса². Было показано, что кавитация, стабильная или инерционная, усиливает проникновение клеточных мембран и, таким образом, усиливает интернализацию лекарств в клетку³.

В терапевтических приложениях понимание механизма взаимодействия пузырьковых клеток очень важно, но есть несколько барьеров, как с научной, так и с технической стороны, которые мешают нашим знаниям продвигаться вперед. Во-первых, уловить динамику клеток в ответ на механические стимулы, вызванные пузырьками, очень сложно⁴. В акустическом масштабе времени колебания микропузырьков первого порядка могут приводить к активации мембранных каналов, облегчая молекулярное прохождение через биологические интерфейсы. Это происходит за счет прямого колебания клеточной мембраны, также называемого «клеточным массажем^»5. Активация канала после прямого механического воздействия была подтверждена с использованием методов патч-зажима, которые измеряли электрофизиологические свойства клеточных мембран во время и после ультразвукового воздействия⁶. Измерение индуцированной пузырьками клеточной динамики (то есть полного поля деформации клеточной мембраны) в акустической шкале времени также даст представление о пороге расширения площади мембраны Δ A/A, необходимого для индуцирования пор в клеточной мембране⁷. Вторым барьером является контроль режима коллапса пузырьков, чтобы избежать лизиса клеток, вызванного микропузырьками. Схлопывание пузырьков и индуцированные микроструи были идентифицированы как механизм, посредством которого происходит перфорация мембраны ^8,9. После проникновения клеточная мембрана восстанавливается за счет самогерметизации липидных бислоев кальция и слияния внутриклеточных везикул⁹. Возникновение схлопывания пузырьков также может привести к летальному повреждению клетки и вызвать ненужные побочные эффекты в окружающих. В чувствительных приложениях, таких как ультразвуковое опосредованное открытие гематоэнцефалического барьера, общепризнано, что следует избегать схлопывания инерционных пузырьков¹⁰.

Поэтому в настоящее время огромные усилия направлены на проектирование последовательностей ультразвукового излучения в сочетании с пассивным кавитационным мониторингом и контролем, чтобы обеспечить стабильные колебания микропузырьков¹¹. В этом стабильном режиме была выдвинута гипотеза о том, что стабильно колеблющиеся пузырьки играют сильную роль в запуске пермеабилизации мембраны, способствуя пространственно-направленному напряжению сдвига на клеточной мембране⁷. Напряжение сдвига возникает из-за потоков жидкости, создаваемых в непосредственной близости от колеблющихся пузырьков. Эти потоки жидкости называются кавитационным микропотоком, и, как упоминалось выше, они являются одним из нескольких возможных механизмов, ответственных за усиленное поглощение внеклеточных молекул. При работе с суспензией пузырьков или клеток, таких как биологические трансфекции in vitro^{анализы 12}, пермеабилизация путем микростриминга может быть гораздо более эффективной, чем пермеабилизация путем коллапса пузырьков. Это можно показать простым геометрическим соображением. В клеточных суспензиях сонопорация будет эффективной, если большинство взвешенных клеток подвергается достаточно большим механическим воздействиям (что приводит к пермеабилизации мембраны). Известно, что схлопывания пузырьков направлены вдоль направления нарушения изотропной симметрии, такой как ось¹³ пузырь-стенка или линия пузырь-пузырь и пузырьковая ячейка, соединяющая их центр^{масс 14}. Таким образом, полученная микроструя представляет собой пространственно-локализованное явление вдоль конечного числа линий, соединяющих клеточный и пузырьковый центры. В зависимости от концентрации клеток и пузырьков, а также расстояния между пузырьковыми клетками этот эффект может быть не самым эффективным для проникновения всего числа взвешенных клеток. Напротив, кавитационный микропоток — это явление, происходящее в медленном временном масштабе, с большим пространственным расширением по сравнению с радиусом пузырька. Кроме того, поток жидкости распределяется по всему пузырьку и, следовательно, может воздействовать на большее количество клеток на очень большом расстоянии. Таким образом, понимание генерируемого кавитационного микропотока вокруг колеблющегося пузырька является необходимым условием для контроля и количественной оценки напряжения сдвига, вызванного пузырьком, которое прикладывается к клеткам.

Для этого предварительный этап состоит в управлении сферическими и несферическими колебаниями пузырька, управляемого ультразвуком, поскольку генерируемые потоки жидкости индуцируются движением границы раздела^15,16 пузырьков. В частности, колебания формы микропузырьков должны запускаться и поддерживаться стабильными. Кроме того, необходимо контролировать ориентацию колебаний формы пузырька, чтобы правильно проанализировать корреляцию между динамикой границы раздела пузырьков и индуцированным микропотоковым паттерном. При обобщении существующей литературы очевидно, что подробные экспериментальные результаты кавитационно-индуцированного микропотока доступны только для пузырьков, прикрепленных к поверхности. Микропузырьки, прикрепленные к стене, обычно используются для оценки точной динамики интерфейса и взаимодействия клеток в микрометровом масштабе в системе сверхбыстрой микроскопии. Эта конфигурация терапевтически актуальна при рассмотрении вибрирующих микропузырьков, расположенных на клеточной мембране^17,18,19. Однако изучение пузырьков, прикрепленных к подложке, может усложнить анализ динамики пузырьков, отчасти из-за сложного характера динамики²⁰ контактной линии и срабатывания мод²¹ асимметричной формы. В медицинских и биологических приложениях пузырьки, которые не прикреплены к стене, обычно встречаются в ограниченных геометрических формах, таких как небольшие сосуды. Это существенно влияет на динамику пузыря и нестабильность формы. В частности, наличие ближайшей стенки смещает порог давления для срабатывания режима формы на более низкие значения давления в зависимости от номера режима формы и размера пузырька²². Стенка также влияет на микропоток, индуцированный пузырьками, с возможно более высокой интенсивностью для создаваемого потока²³.

Среди всех возможных сценариев, с которыми могут столкнуться микропузырьки (свободные или прикрепленные, близко к стене, коллапсирующие или стабильно колеблющиеся), мы предлагаем исследовать несферическую динамику одного пузыря вдали от любой границы. Экспериментальная установка основана на системе²⁴ акустической левитации, в которой стоячая ультразвуковая волна используется для улавливания пузыря. Этот сценарий согласуется с медицинскими приложениями, в которых набор взвешенных пузырьков и клеток сосуществует, например, в камере сонотрансфекции. Поскольку пузырьки и ячейки расположены не слишком близко, предполагается, что наличие ячейки не влияет на динамику границы раздела пузырьков. Когда клетки следуют петлевым траекториям кавитационно-индуцированного микропотока, они циклически приближаются и отталкиваются от местоположения пузырька, и мы можем предположить, что присутствие клетки не влияет ни на картину потока, ни на его среднюю скорость. Кроме того, с теоретической точки зрения хорошо известны несферическая динамика и индуцированные микропотоки от одиночных пузырьков, удаленных от границы. Чтобы связать индуцированный пузырьками поток жидкости с динамикой контура пузырька, необходимо точно охарактеризовать динамику границы раздела пузырьков. Для этого предпочтительно адаптировать пространственно-временной масштаб в экспериментальных исследованиях по отношению к тем, которые используются в терапии, таким образом, чтобы сбор данных с помощью обычных высокоскоростных камер (менее 1 миллиона кадров в секунду) был возможен с использованием больших пузырьков, возбужденных на более низких частотах. При рассмотрении пузырьков без покрытия собственная частота ω n данной моды _n связана с размером пузырька как ²⁵. Это соотношение радиус-собственная частота несколько изменяется при рассмотрении оболочечных пузырьков²⁶, но порядок величины собственной частоты ω_n остается прежним. Таким образом, исследование пузырьков с равновесными радиусами ~ 50 мкм в ультразвуковом поле 30 кГц аналогично изучению покрытых пузырьков радиусом ~ 3 мкм в поле 1,7 МГц, как предложено Dollet et ^al.27. Таким образом, ожидаются аналогичные номера режимов формы и, следовательно, микропотоковые шаблоны.

Для того, чтобы вызвать несферические колебания границы раздела пузырьков, необходимо превысить определенный порог давления, зависящий от радиуса, как показано на рисунке 1. Существующие экспериментальные методы основаны на увеличении акустического давления для запуска поверхностных мод (проиллюстрированных траекторией (1) на рисунке 1) либо путем ступенчатого повышения^{давления 28} , либо путем возбуждения с модулированной амплитудой, ответственного за периодическое возникновение и исчезновение поверхностных мод²⁹. Основными недостатками этих методов являются: (i) случайная ориентация оси симметрии поверхностных колебаний, которые не могут контролироваться в плоскости изображения, (ii) короткое время жизни колебаний в форме пузырьков, что затрудняет анализ индуцированных потоков жидкости в больших временных масштабах, и (iii) частое срабатывание неустойчивых мод формы. Мы предлагаем альтернативный метод пересечения порога давления при постоянном акустическом давлении на карте радиус/давление, как показано на пути (2) на рисунке 1. Для этого необходимо увеличить размер пузырька так, чтобы он находился в зоне нестабильности. Такое увеличение выполняется методом пузырьковой коалесценции. Слияние двух, первоначально сферически колеблющихся, микропузырьков используется для создания одного деформированного пузыря. Если акустическое давление и размер пузырьков слипшегося пузырька находятся в зоне неустойчивости, срабатывают поверхностные моды. Мы также доказали, что метод коалесценции индуцирует колебания устойчивой формы в установившемся режиме, а также управляемую ось симметрии, определяемую прямолинейным движением двух приближающихся пузырьков. Поскольку колебания стабильной формы обеспечиваются в течение нескольких минут, анализ потока жидкости, вызванного пузырьками, возможен путем засева жидкой среды флуоресцентными микрочастицами, освещенными тонким лазерным листом. Регистрация движения твердых микрочастиц в непосредственной близости от границы раздела пузырьков позволяет идентифицировать закономерность индуцированного потока^{жидкости 30}. Общий принцип срабатывания колебаний в форме пузырьков, приводящих к стабильному по времени течению жидкости, проиллюстрирован на рисунке 2.

В следующем протоколе мы описываем шаги, необходимые для создания стабильных колебаний в форме пузырьков с помощью метода коалесценции, и описываем измерения потока жидкости. Это включает в себя проектирование системы акустической левитации, акустическую калибровку, зарождение пузырьков и метод коалесценции, измерение динамики границы раздела пузырьков и окружающего потока жидкости, а также обработку изображений.