تحريض التدفق الدقيق بواسطة تذبذبات الفقاعات غير الكروية في نظام الرفع الصوتي

في الطب ، يجب أن يخترق الدواء المدار العديد من العقبات في النظام الحي قبل الوصول إلى الأهداف المرجوة. ومع ذلك ، يتم تنظيف معظم الأدوية بسرعة بعيدا عن مجرى الدم. كفاءة الاستهداف منخفضة ولا يمكنها عبور أغشية الخلايا بسهولة ، مما يؤدي إلى توصيل الدواء بشكل غير فعال. حاليا ، تم اقتراح استخدام الفقاعات الدقيقة مع الموجات فوق الصوتية كطريقة مبتكرة للتوصيل غير الجراحي والدقيق والمستهدف للأدوية والجينات إلى الأنسجة والخلايا المرضية¹. في هذا النهج ، يمكن أن تلعب الفقاعات الدقيقة دورا كناقلات حيث يتم حقن الأدوية المجانية إما بتعليق فقاعة الغاز أو تحميلها على سطحها. يمكن أن تعمل الفقاعات الدقيقة أيضا كناقل محلي لإعادة تركيز طاقة الموجات فوق الصوتية من أجل التفاعل مع الخلايا. في الأساس ، تحت التعرض للموجات فوق الصوتية ، تضغط الفقاعات وتتوسع بثبات ، وهو نظام يسمى التجويف المستقر الذي يولد تدفقات سائلة وبالتالي إجهاد القص على الأشياء القريبة. قد تتذبذب الفقاعات الدقيقة أيضا بشكل غير خطي وتتوسع حتى الانهيار ، في نظام التجويف بالقصور الذاتي ، مما ينتج عنه موجات صدمة تنتشر شعاعيا من موقع الانهيار². لقد ثبت أن التجويف ، سواء كان مستقرا أو بالقصور الذاتي ، يعزز نفاذية أغشية الخلايا ، وبالتالي يعزز استيعاب الأدوية في الخلية³.

في التطبيقات العلاجية ، يعد فهم آلية تفاعل خلية الفقاعة أمرا مهما للغاية ، ولكن هناك العديد من الحواجز ، من الجانبين العلمي والتقني ، التي تمنع معرفتنا من التقدم. أولا ، من الصعب للغاية التقاط ديناميكيات الخلايا استجابة للمحفزات الميكانيكية التي تسببها الفقاعات⁴. في النطاق الزمني الصوتي ، يمكن أن تؤدي تذبذبات الفقاعات الدقيقة من الدرجة الأولى إلى تنشيط قنوات الغشاء ، مما يسهل المرور الجزيئي عبر الواجهات البيولوجية. يحدث هذا من خلال التذبذب المباشر لغشاء الخلية ، ويسمى أيضا “التدليك الخلوي”⁵. تم إثبات تنشيط القناة بعد الإجهاد الميكانيكي المباشر باستخدام تقنيات المشبك الرقعي التي تقيس الخصائص الفيزيولوجية الكهربية لأغشية الخلايا أثناء وبعد التعرض للموجات فوق الصوتية⁶. إن قياس ديناميكيات الخلايا التي تسببها الفقاعات (بمعنى المجال الكامل لتشوه غشاء الخلية) على النطاق الزمني الصوتي ، سيوفر أيضا رؤى حول عتبة توسع منطقة الغشاء Δ A/ A المطلوبة لحث المسام في غشاء الخلية⁷. الحاجز الثاني هو التحكم في نظام الفقاعة المنهارة لتجنب تحلل الخلايا الناجم عن الفقاعات الدقيقة. تم تحديد انهيار الفقاعات والنفاثات الدقيقة المستحثة كآلية يحدث من خلالها ثقب الغشاء ^8,9. بمجرد أن يتخلل ، يتم إصلاح غشاء الخلية من خلال الختم الذاتي للكالسيوم للطبقات الثنائية الدهنية واندماج الحويصلات داخل الخلايا⁹. قد يتسبب حدوث انهيارات الفقاعات أيضا في حدوث أضرار قاتلة للخلية وإحداث آثار جانبية غير ضرورية في الخلايا المحيطة. في التطبيقات الحساسة مثل فتح الحاجز الدموي الدماغي بوساطة الموجات فوق الصوتية ، من المقبول عموما أنه يجب تجنب انهيار الفقاعات بالقصور الذاتي¹⁰.

لذلك ، يتم حاليا تكريس جهود ضخمة لتصميم تسلسل انبعاثات الموجات فوق الصوتية ، إلى جانب مراقبة التجويف السلبي والتحكم فيه ، من أجل ضمان تذبذبات مستقرة للفقاعات الدقيقة¹¹. في هذا النظام المستقر ، تم افتراض أن الفقاعات المتذبذبة بشكل ثابت تلعب دورا قويا في تحفيز نفاذية الغشاء من خلال تعزيز إجهاد القص المستهدف مكانيا على غشاء الخلية⁷. ينتج إجهاد القص عن تدفقات السائل الناتجة بالقرب من الفقاعات المتذبذبة. تسمى هذه التدفقات السائلة microstreaming التجويف ، وكما ذكر أعلاه ، فهي واحدة من العديد من الآليات الممكنة المسؤولة عن تعزيز امتصاص الجزيئات خارج الخلية. عند التعامل مع تعليق الفقاعات أو الخلايا مثل فحوصات النقل البيولوجي في المختبر¹² ، قد تكون النفاذية عن طريق البث الدقيق أكثر كفاءة من النفاذية عن طريق انهيار الفقاعة. يمكن إظهار ذلك من خلال اعتبار هندسي بسيط. في تعليق الخلية ، سيكون sonoporation فعالا إذا تم تقديم غالبية الخلايا المعلقة لتأثيرات ميكانيكية كبيرة بما فيه الكفاية (مما يؤدي إلى نفاذية الغشاء). من المعروف أن انهيارات الفقاعات يتم توجيهها على طول اتجاه كسر التماثل الخواص ، مثل محور جدار الفقاعة¹³ أو خط الفقاعة وخلية الفقاعة الذي ينضم إلى مركز الكتلة¹⁴. وبالتالي فإن النفاثة الصغيرة المنتجة هي ظاهرة موضعية مكانيا على طول عدد محدود من الخطوط التي تربط مراكز الخلية والفقاعات. اعتمادا على تركيز الخلية والفقاعة ، وكذلك المسافة بين خلية الفقاعة ، قد لا يكون هذا التأثير هو الأكثر كفاءة لاختراق العدد الكامل للخلايا العالقة. في المقابل ، يعد التدفق الدقيق للتجويف ظاهرة تحدث في نطاق زمني بطيء ، مع توسع مكاني كبير مقارنة بنصف قطر الفقاعة. أيضا ، يتم توزيع تدفق السائل في جميع أنحاء الفقاعة ، وبالتالي قد يؤثر على عدد أكبر من الخلايا ، على مدى طويل جدا. لذلك ، فإن فهم التدفق الدقيق للتجويف المتولد حول فقاعة متذبذبة هو شرط أساسي للتحكم في إجهاد القص الناجم عن الفقاعة الذي يتم تطبيقه على الخلايا وتحديده.

للقيام بذلك ، تتمثل الخطوة الأولية في التحكم في التذبذبات الكروية وغير الكروية للفقاعة التي تحركها الموجات فوق الصوتية ، حيث يتم تحفيز تدفقات السائل المتولدة بواسطة حركة واجهة الفقاعة^15,16. على وجه الخصوص ، يجب تشغيل تذبذبات شكل الفقاعات الدقيقة والحفاظ على استقرارها. علاوة على ذلك ، يجب التحكم في اتجاه تذبذبات شكل الفقاعة لتحليل العلاقة بين ديناميكيات واجهة الفقاعة ونمط التدفق الدقيق المستحث بشكل صحيح. عند تلخيص الأدبيات الموجودة ، من الواضح أن النتائج التجريبية التفصيلية للتدفق الدقيق الناجم عن التجويف متاحة فقط للفقاعات المرتبطة بالسطح. تستخدم الفقاعات الدقيقة المتصلة بالجدار بشكل شائع لتقييم ديناميكيات الواجهة الدقيقة وتفاعلات الخلايا على مقياس الميكرومتر تحت نظام الفحص المجهري فائق السرعة. هذا التكوين مناسب علاجيا عند التفكير في الفقاعات الدقيقة المهتزة الموجودة على غشاء الخلية¹⁷،^18،19. ومع ذلك ، فإن دراسة الفقاعة المرتبطة بالركيزة قد تجعل تحليل ديناميكيات الفقاعات أكثر تعقيدا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الطبيعة المعقدة لديناميكيات خط الاتصال²⁰ ، وتشغيل أوضاع الشكل غير المتماثل²¹. في التطبيقات الطبية والبيولوجية ، توجد الفقاعات غير المتصلة بالجدار بشكل شائع في الأشكال الهندسية المحصورة مثل الأوعية الصغيرة. هذا يؤثر بشكل كبير على ديناميكيات الفقاعة وعدم استقرار الشكل. على وجه الخصوص ، يؤدي وجود جدار قريب إلى تحويل عتبة الضغط لوضع الشكل مما يؤدي إلى انخفاض قيم الضغط اعتمادا على رقم وضع الشكل وحجم الفقاعة²². يؤثر الجدار أيضا على التدفق الدقيق الناجم عن الفقاعة مع احتمال كثافة أعلى للتدفق المنتج²³.

من بين جميع السيناريوهات المحتملة التي قد تواجهها الفقاعات الدقيقة (حرة أو متصلة ، قريبة من جدار ، تنهار أو تتأرجح بثبات) ، نقترح التحقيق في الديناميكيات غير الكروية لفقاعة واحدة بعيدة عن أي حدود. يعتمد الإعداد التجريبي على نظام الرفع الصوتي²⁴ حيث يتم استخدام موجة الموجات فوق الصوتية الدائمة لاحتجاز الفقاعة. يتوافق هذا السيناريو مع التطبيقات الطبية التي تتعايش فيها مجموعة من الفقاعات والخلايا العالقة في غرفة نقل الصوت ، على سبيل المثال. بقدر ما تكون الفقاعات والخلايا ليست قريبة جدا ، فمن المفترض أن وجود خلية لا يؤثر على ديناميكيات واجهة الفقاعة. عندما تتبع الخلايا المسارات الشبيهة بالحلقة للتدفق الدقيق الناجم عن التجويف ، فإنها تقترب بشكل دوري وتتنافر من موقع الفقاعة ويمكننا أن نفترض أن وجود الخلية لا يؤثر على نمط التدفق ولا سرعته المتوسطة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الديناميكيات غير الكروية والتدفق الدقيق المستحث من فقاعات مفردة بعيدة عن الحدود معروفة جيدا من وجهة نظر نظرية. من أجل ربط تدفق السائل الناجم عن الفقاعة بديناميكيات كفاف الفقاعة ، يلزم توصيف ديناميكيات واجهة الفقاعة بدقة. للقيام بذلك ، من الأفضل تكييف النطاق الزماني المكاني في الدراسات التجريبية فيما يتعلق بتلك المستخدمة في العلاجات بحيث يكون الحصول على كاميرات عالية السرعة شائعة (أقل من 1 مليون إطار / ثانية) ممكنا باستخدام فقاعات كبيرة متحمسة عند ترددات منخفضة. عند النظر في الفقاعات غير المطلية ، يرتبط التردد الذاتي ω n لنمط معين _n بحجم الفقاعة مثل ²⁵. يتم تعديل علاقة نصف القطر والتردد الذاتي هذه بشكل طفيف عند النظر في الفقاعات المقشرة²⁶ ، لكن ترتيب حجم التردد الذاتي ω_n يظل كما هو. وبالتالي ، فإن فحص الفقاعات ذات أنصاف أقطار التوازن ~ 50 ميكرومتر في مجال الموجات فوق الصوتية 30 كيلو هرتز يشبه دراسة الفقاعات المغلفة من أنصاف الأقطار ~ 3 ميكرومتر في مجال 1.7 ميجاهرتز ، على النحو الذي اقترحه Dollet et ^al.27. لذلك من المتوقع أن تكون أرقام وضع الشكل مماثلة وبالتالي أنماط البث المصغر.

من أجل تشغيل تذبذبات غير كروية لواجهة الفقاعة ، من الضروري تجاوز عتبة ضغط معينة تعتمد على نصف القطر ، كما هو موضح في الشكل 1. تعتمد التقنيات التجريبية الحالية على زيادة الضغط الصوتي لتحريك الأنماط السطحية (الموضحة بالمسار (1) في الشكل 1) ، إما عن طريق زيادة الضغط خطوة بخطوة²⁸ أو عن طريق إثارة السعة المعدلة المسؤولة عن البداية الدورية وانقراض أوضاع السطح²⁹. العيوب الرئيسية لهذه التقنيات هي (i) الاتجاه العشوائي لمحور التماثل للتذبذبات السطحية التي لا يمكن التحكم فيها لتكون في مستوى التصوير ، (ii) عمر قصير لتذبذبات شكل الفقاعة التي تجعل تحليل تدفقات السائل المستحثة صعبا في نطاقات زمنية أكبر ، و (iii) التشغيل المتكرر لأوضاع الشكل غير المستقرة. نقترح تقنية بديلة لعبور عتبة الضغط عند ضغط صوتي ثابت في خريطة نصف القطر / الضغط ، كما هو موضح في المسار (2) في الشكل 1. للقيام بذلك ، يلزم زيادة حجم الفقاعة بحيث تكون في منطقة عدم الاستقرار. يتم تنفيذ هذه الزيادة بواسطة تقنية اندماج الفقاعة. يتم استغلال اندماج فقاعتين صغيرتين ، متذبذبتين كرويا في البداية ، لإنشاء فقاعة واحدة مشوهة. إذا كان الضغط الصوتي وحجم الفقاعة للفقاعة المدمجة في منطقة عدم الاستقرار ، يتم تشغيل أوضاع السطح. لقد أثبتنا أيضا أن تقنية الالتحام تحفز تذبذبات الشكل المستقر في نظام الحالة المستقرة ، بالإضافة إلى محور تناظر متحكم فيه تحدده الحركة المستقيمة للفقاعتين المقتربتين. نظرا لأن تذبذب الشكل المستقر مضمون على مدار دقائق ، فإن تحليل تدفق السوائل الناجم عن الفقاعات ممكن عن طريق بذر الوسط السائل بجزيئات دقيقة فلورية مضاءة بواسطة ورقة ليزر رقيقة. يسمح تسجيل حركة الجسيمات الدقيقة الصلبة بالقرب من واجهة الفقاعة بتحديد نمط تدفق السائل المستحث³⁰. يوضح الشكل 2 المبدأ العام لتحفيز تذبذبات شكل الفقاعة ، مما يؤدي إلى تدفق سائل مستقر زمنيا.

في البروتوكول التالي ، نوضح الخطوات المطلوبة لإنشاء تذبذبات مستقرة على شكل فقاعة عبر تقنية الالتحام ونصف قياسات تدفق السوائل. يتضمن ذلك تصميم نظام الرفع الصوتي ، والمعايرة الصوتية ، ونواة الفقاعات وتقنية الالتحام ، وقياس ديناميكيات واجهة الفقاعة وتدفق السوائل المحيطة ، ومعالجة الصور.