Ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en las células

Después de su descubrimiento en los años noventa, se desarrollaron péptidos penetrantes en las células (CPP) para promover una entrega celular eficiente de cargas a través de la membrana plasmática^1,2. Los CPP suelen ser péptidos cortos, generalmente de 8 a 30 aminoácidos, que tienen una amplia variedad de orígenes. Primero se definieron como portadores de “translocación directa”, lo que significa que pudieron cruzar la membrana plasmática y transferir una carga a las células independientemente de cualquier vía endocitótica, ni el requerimiento de energía ni la participación del receptor. Sin embargo, investigaciones posteriores revelaron que estas primeras observaciones provenían principalmente de la sobreestimación de la fluorescencia debido al artefacto experimental y / o a los protocolos de fijación utilizando metanol³. Hoy en día, es ampliamente aceptado que la captación de CPP tiene lugar tanto por endocitosis como por translocación independiente de la energía^4,5,6,7 dependiendo de diferentes parámetros como la naturaleza de la carga, el enlace utilizado entre CPP y carga, la línea celular estudiada, etc.

Los CPP se pueden utilizar como agentes de transfección de acuerdo con dos estrategias, ya sea que impliquen un enlace químico (estrategia covalente) o interacciones electrostáticas/hidrofóbicas (estrategia no covalente) entre el CPP y su carga^8,9,10,11. Aunque ambas estrategias han demostrado su eficiencia en la transferencia celular de varias cargas, la comprensión del mecanismo de internalización por parte de los CPPs aún está en controversia y el equilibrio entre las vías de endocitosis o la penetración directa sigue siendo difícil de medir^12,13. Aunque se dispone de un conjunto de herramientas y estrategias experimentales para abordar claramente la implicación de los procesos endocíticos, la translocación directa parece, sin embargo, más difícil de caracterizar ya que implica interacciones más discretas con los componentes de la membrana plasmática. Las membranas biológicas suelen estar compuestas por numerosos componentes, desde fosfolípidos hasta proteínas de membrana, que pueden variar según el tipo celular y/o el entorno (condiciones de estrés, división celular, etc.). Esta diversidad de composición, y en consecuencia la ausencia de un modelo universal de membrana celular no permite estudios de una sola manera. Sin embargo, para eludir estas limitaciones, se desarrollaron enfoques paso a paso con membrana artificial o extractos de membrana. Desde pequeñas vesículas unilamelares hasta enfoques monocapa, cada modelo era claramente pertinente para responder preguntas específicas^14,15. Entre ellas, las grandes vesículas unilamelares (LUV) constituyen un modelo de imitación de membrana apropiado para estudiar las interacciones péptido/membrana como un punto clave en el proceso de internalización.

En este contexto, el siguiente protocolo describe la investigación de los efectos de los péptidos y las interacciones péptido/membrana sobre la integridad de las LUV a través de la monitorización tanto de un colorante fluorescente aniónico como de su correspondiente quencher policationico encapsulado en liposomas. Esta herramienta se utiliza para estudiar las interacciones CPP/membrana con el fin de comprender si son capaces de realizar una translocación directa de membrana. Aunque generalmente se aplica para comparar diferentes péptidos que interactúan con la membrana, este ensayo de fuga de fluorescencia LUV también podría usarse para investigar tanto conjugados CPP-carga (estrategia covalente) como complejos CPP:carga (estrategia no covalente).

Por lo tanto, el presente protocolo se ejemplificará por primera vez con los péptidos anfipáticos (WRAP) ricos en triptófano (W) y arginina (R) recientemente desarrollados¹⁶. WRAP es capaz de formar nanopartículas basadas en péptidos para entregar rápida y eficientemente pequeño ARN interferente (siRNA) en varias líneas celulares¹⁶. Se monitorearon las propiedades de fuga de fluorescencia del péptido WRAP solo o las nanopartículas basadas en WRAP cargadas de siRNA para caracterizar su mecanismo de internalización celular. Demostramos que su mecanismo de internalización implicaba principalmente la translocación directa⁷. En un segundo ejemplo, el péptido WRAP se conjudicó covalentemente con el péptido interferente proteína/proteína iCAL36 (WRAP-iCAL36)¹⁷ y su capacidad para desestabilizar membranas se comparó en un ensayo de fuga de fluorescencia con iCAL36 acoplado a Penetratin¹⁸ (Penetratin-iCAL36), otro CPP.

Finalmente, se discutirán las ventajas y limitaciones del método tanto desde un punto de vista tecnológico como con respecto a la relevancia biológica.