Анализ флуоресцентных утечек для исследования дестабилизации мембраны проникающим в клетки пептидом

После их открытия в девяностые годы были разработаны проникающие в клетки пептиды (CPP) для содействия эффективной клеточной доставке грузов через плазматическую мембрану^1,2. CPP обычно представляют собой короткие пептиды, обычно от 8 до 30 аминокислот, имеющие широкий спектр происхождения. Сначала они были определены как «прямо-транслокирующие» носители, то есть они были способны пересекать плазматическую мембрану и переносить груз в клетки независимо от любого эндоцитотического пути, ни от потребности в энергии, ни от участия рецептора. Однако дальнейшие исследования показали, что эти первые наблюдения в основном произошли от переоценки флуоресценции из-за экспериментального артефакта и / или протоколов фиксации с использованием метанола^3. В настоящее время широко признано, что поглощение CPP происходит как эндоцитозом, так и энергонезависимой транслокацией^4,5,6,7 в зависимости от различных параметров, таких как характер груза, используемая связь между CPP и грузом, исследуемая клеточная линия и т. Д.

CPP могут быть использованы в качестве трансфекционных агентов в соответствии с двумя стратегиями, либо включающими химическую связь (ковалентная стратегия), либо электростатические/гидрофобные взаимодействия (нековалентная стратегия) между CPP и его грузом^8,9,10,11. Хотя обе стратегии показали свою эффективность в клеточном переносе нескольких грузов, понимание механизма интернализации СПП все еще находится под спорным вопросом, и баланс между путями эндоцитоза или прямым проникновением все еще трудно измерить^12,13. Хотя имеется набор экспериментальных инструментов и стратегий для четкого решения проблемы участия эндоцитарных процессов, прямую транслокацию, по-видимому, сложнее охарактеризовать, поскольку она подразумевает более дискретные взаимодействия с компонентами плазматической мембраны. Биологические мембраны обычно состоят из многочисленных компонентов, от фосфолипидов до мембранных белков, которые могут варьироваться в зависимости от типа клеток и / или окружающей среды (стрессовые условия, деление клеток и т. Д.). Такое разнообразие состава, а следовательно, и отсутствие универсальной модели клеточной мембраны не позволяет проводить исследования единым способом. Однако для обхода этих ограничений были разработаны пошаговые подходы с искусственными мембранными или мембранными экстрактами. От небольших одноламеллярных везикул до однослойных подходов, каждая модель явно уместна для ответа на конкретные вопросы^14,15. Среди них большие одноламелляторные везикулы (LUV) представляют собой подходящую модель, имитирурующей мембрану, для изучения пептидных / мембранных взаимодействий в качестве ключевого момента в процессе интернализации.

В этом контексте следующий протокол описывает исследование влияния пептидов и пептидно-мембранных взаимодействий на целостность LUV посредством мониторинга как анионного флуоресцентного красителя, так и соответствующего ему поликатионного гасища, инкапсулированного в липосомах. Этот инструмент используется для изучения взаимодействия CPP / мембраны, чтобы понять, способны ли они выполнять прямую мембранную транслокацию. Хотя этот анализ утечки флуоресценции LUV обычно применяется для сравнения различных мембранно-взаимодействующих пептидов, он также может быть использован для исследования как конъюгатов CPP-груза (ковалентная стратегия), так и комплексов CPP: груз (нековалентная стратегия).

Таким образом, настоящий протокол будет впервые проиллюстрирован недавно разработанными триптофанами (W)- и аргинин(R)-богатыми амфипатическими пептидами (WRAP)^16. WRAP способен образовывать наночастицы на основе пептидов для быстрой и эффективной доставки малых интерферионных РНК (siRNA) в несколько клеточных линий^16. Для характеристики их механизма клеточной интернализации контролировались свойства флуоресцентной утечки только пептида WRAP или наночастиц на основе WRAP, нагруженных siRNA. Мы показали, что их механизм интернализации в основном связан с прямой транслокацией^7. Во втором примере пептид WRAP был ковалентно конъюгирован с белком/белковым интерферирующим пептидом iCAL36 (WRAP-iCAL36)^17, и его способность дестабилизировать мембраны сравнивали в анализе утечки флуоресценции с iCAL36 в сочетании с Penetratin¹⁸ (Penetratin-iCAL36), другим CPP.

Наконец, преимущества и ограничения метода будут обсуждаться как с технологической точки зрения, так и с точки зрения биологической значимости.