Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

Dopo la loro scoperta negli anni novanta, sono stati sviluppati peptidi penetranti nelle cellule (CPP) per promuovere un efficiente trasporto cellulare di carichi attraverso la membrana^{plasmatica 1,2.} I CPP sono di solito peptidi corti, generalmente da 8 a 30 amminoacidi, con un’ampia varietà di origini. Sono stati inizialmente definiti come portatori “traslocanti diretti”, il che significa che erano in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule indipendentemente da qualsiasi via endocitotica né dal fabbisogno energetico né dal coinvolgimento del recettore. Tuttavia, ulteriori indagini hanno rivelato che queste prime osservazioni provenivano principalmente da sovrastima di fluorescenza dovuta all’artefatto sperimentale e / o ai protocolli di fissazione che utilizzavano metanolo³. Al giorno d’oggi, è ampiamente accettato che l’assorbimento di CPP avviene sia per endocitosi che per traslocazione indipendente dall’energia^4,5,^6,7 a seconda di diversi parametri come la natura del carico, il collegamento utilizzato tra CPP e carico, la linea cellulare studiata, ecc.

I CPP possono essere utilizzati come agenti di trasfezione secondo due strategie, che coinvolgono un legame chimico (strategia covalente) o interazioni elettrostatiche / idrofobiche (strategia non covalente) tra il CPP e il suo carico^8,9,10,11. Sebbene entrambe le strategie abbiano dimostrato la loro efficienza nel trasferimento cellulare di diversi carichi, la comprensione del meccanismo di internalizzazione da parte dei CPP è ancora controversa e l’equilibrio tra vie di endocitosi o penetrazione diretta è ancora difficile da misurare^12,13. Sebbene sia disponibile una serie di strumenti e strategie sperimentali per affrontare chiaramente il coinvolgimento dei processi endocitici, la traslocazione diretta sembra, tuttavia, più difficile da caratterizzare poiché implica interazioni più discrete con i componenti della membrana plasmatica. Le membrane biologiche sono solitamente composte da numerosi componenti, dai fosfolipidi alle proteine di membrana, che possono variare a seconda del tipo cellulare e/o dell’ambiente (condizioni di stress, divisione cellulare, ecc.). Questa diversità di composizione, e di conseguenza l’assenza di un modello di membrana cellulare universale, non consente studi in un unico modo. Tuttavia, per aggirare queste limitazioni sono stati sviluppati approcci passo-passo con estratti di membrana o membrana artificiali. Dalle piccole vescicole unilamellari agli approcci monostrato, ogni modello era chiaramente pertinente per rispondere alle domande specifiche^14,15. Tra questi, le grandi vescicole unilamellari (LUV) costituiscono un modello appropriato di imitazione della membrana per studiare le interazioni peptide/ membrana come punto chiave nel processo di internalizzazione.

In questo contesto, il seguente protocollo descrive lo studio degli effetti dei peptidi e delle interazioni peptidi/membrana sull’integrità dei LUD attraverso il monitoraggio sia di un colorante fluorescente anionico che del corrispondente quencher policanica incapsulato in liposomi. Questo strumento viene utilizzato per studiare le interazioni CPP/membrana al fine di capire se sono in grado di eseguire una traslocazione diretta della membrana. Sebbene di solito applicato per confrontare diversi peptidi che interagiscono con la membrana, questo saggio di perdita di fluorescenza LUV potrebbe anche essere utilizzato per studiare sia i coniugati CPP-cargo (strategia covalente) che i complessi CPP:cargo (strategia non covalente).

Il presente protocollo sarà quindi prima esemplificato con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WRAP)¹⁶recentemente sviluppati. WRAP è in grado di formare nanoparticelle a base di peptidi per fornire rapidamente ed efficacemente piccoli RNA interferenti (siRNA) in diverse linee cellulari¹⁶. Le proprietà di perdita di fluorescenza del peptide WRAP da solo o delle nanoparticelle a base di WRAP caricate con siRNA sono state monitorate per caratterizzare il loro meccanismo di internalizzazione cellulare. La Corte ha dimostrato che il loro meccanismo di internalizzazione riguardava principalmente la traslocazione diretta⁷. In un secondo esempio, il peptide WRAP è stato coniugato covalentemente al peptide interferente proteina/proteina iCAL36 (WRAP-iCAL36)¹⁷ e la sua capacità di destabilizzare le membrane è stata confrontata in un saggio di perdita di fluorescenza con iCAL36 accoppiato a Penetratin¹⁸ (Penetratin-iCAL36), un altro CPP.

Infine, verranno discussi i vantaggi e i limiti del metodo sia dal punto di vista tecnologico che rispetto alla rilevanza biologica.