Test de fuite fluorescente pour étudier la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules

Après leur découverte dans les années quatre-vingt-dix, des peptides pénétrant dans les cellules (CPP) ont été développés pour favoriser une livraison cellulaire efficace des cargaisons à travers la membrane^{plasmique 1,2.} Les CPP sont généralement des peptides courts, généralement de 8 à 30 acides aminés, ayant une grande variété d’origines. Ils ont d’abord été définis comme des porteurs « à translocation directe », ce qui signifie qu’ils étaient capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules indépendamment de toute voie endocytotique, ni besoin en énergie ni implication des récepteurs. Cependant, d’autres investigations ont révélé que ces premières observations provenaient principalement d’une surestimation de la fluorescence due à l’artefact expérimental et/ou à des protocoles de fixation utilisant du méthanol^3. De nos jours, il est largement admis que l’absorption du RPC se fait à la fois par endocytose et par translocation indépendante de l’énergie^4,5,6,7 en fonction de différents paramètres tels que la nature de la cargaison, le lien utilisé entre le CPP et la cargaison, la lignée cellulaire étudiée, etc.

Les CPP peuvent être utilisés comme agents de transfection selon deux stratégies, impliquant soit un lien chimique (stratégie covalente), soit des interactions électrostatiques/hydrophobes (stratégie non covalente) entre le CPP et sa cargaison^8,9,10,11. Bien que les deux stratégies aient montré leur efficacité dans le transfert cellulaire de plusieurs cargaisons, la compréhension du mécanisme d’internalisation par les CPP est encore controversée et l’équilibre entre les voies d’endocytose ou la pénétration directe est encore difficile à mesurer^12,13. Bien qu’un ensemble d’outils et de stratégies expérimentaux soient disponibles pour aborder clairement l’implication des processus endocytaires, la translocation directe semble toutefois plus difficile à caractériser car elle implique des interactions plus discrètes avec les composants de la membrane plasmique. Les membranes biologiques sont généralement composées de nombreux composants, des phospholipides aux protéines membranaires, qui peuvent varier selon le type cellulaire et/ou l’environnement (conditions de stress, division cellulaire, etc.). Cette diversité de composition, et par conséquent l’absence d’un modèle universel de membrane cellulaire ne permet pas des études d’une seule manière. Cependant, pour contourner ces limitations, des approches étape par étape ont été développées avec des membranes artificielles ou des extraits de membrane. Des petites vésicules unilamellaires aux approches monocouches, chaque modèle était clairement pertinent pour répondre à des questions spécifiques^14,15. Parmi eux, les grandes vésicules unilamellaires (LV) constituent un modèle membranaire approprié pour étudier les interactions peptide/membrane comme étant un point clé du processus d’internalisation.

Dans ce contexte, le protocole suivant décrit l’étude des effets des peptides et des interactions peptide/membrane sur l’intégrité des LV grâce à la surveillance d’un colorant fluorescent anionique et de son quencher poly-cationique correspondant encapsulé dans des liposomes. Cet outil est utilisé pour étudier les interactions CPP/membrane afin de comprendre s’ils sont capables d’effectuer une translocation membranaire directe. Bien qu’il soit généralement appliqué pour comparer différents peptides interagissant avec la membrane, ce test de fuite de fluorescence LUV pourrait également être utilisé pour étudier à la fois les conjugués CPP-cargo (stratégie covalente) et les complexes CPP:cargo (stratégie non covalente).

Le présent protocole sera donc d’abord illustré avec les peptides amphipathiques riches en tryptophane (W) et en arginine (R) récemment développés^16. WRAP est capable de former des nanoparticules à base de peptides pour délivrer rapidement et efficacement de petits ARN interférents (siRNA) dans plusieurs lignées cellulaires^16. Les propriétés de fuite de fluorescence du peptide WRAP seul ou des nanoparticules à base de WRAP chargées de siRNA ont été surveillées pour caractériser leur mécanisme d’internalisation cellulaire. Nous avons montré que leur mécanisme d’internalisation impliquait principalement une translocation directe^7. Dans un deuxième exemple, le peptide WRAP a été conjugué de manière covalente au peptide interférent protéine/protéine iCAL36 (WRAP-iCAL36)¹⁷ et sa capacité à déstabiliser les membranes a été comparée dans un test de fuite de fluorescence à iCAL36 couplé à Penetratin¹⁸ (Penetratin-iCAL36), un autre CPP.

Enfin, les avantages et les limites de la méthode seront discutés à la fois d’un point de vue technologique et en ce qui concerne la pertinence biologique.