Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken
Summary
De fluorescentielekkagetest is een eenvoudige methode die het onderzoek van peptide / membraaninteracties mogelijk maakt om hun betrokkenheid bij verschillende biologische processen te begrijpen en vooral het vermogen van cel-penetrerende peptiden om fosfolipiden bilayers te verstoren tijdens een direct cellulair translocatieproces.
Abstract
Cel-penetrerende peptiden (CPP’s) worden gedefinieerd als dragers die in staat zijn om het plasmamembraan te passeren en een lading in cellen over te brengen. Een van de belangrijkste gemeenschappelijke kenmerken die nodig zijn voor deze activiteit was het gevolg van de interacties van CPP’s met het plasmamembraan (lipiden) en meer in het bijzonder met componenten van de extracellulaire matrix van het membraan zelf (heparansulfaat). Inderdaad, onafhankelijk van de directe translocatie of de endocytose-afhankelijke internalisatie, zijn lipide bilayers betrokken bij het internalisatieproces, zowel op het niveau van het plasmamembraan als op het niveau van intracellulair verkeer (endosomale blaasjes). In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol dat de verschillende stappen beschrijft van een formulering, zuivering, karakterisering en toepassing in fluorescentielekkagetest om mogelijke CPP-membraan destabilisatie / interactie te detecteren en hun rol in het internalisatiemechanisme aan te pakken. LUVs met een lipidesamenstelling die het plasmamembraangehalte weerspiegelt, worden gegenereerd om zowel een fluorescerende kleurstof als een quencher in te kapselen. De toevoeging van peptiden in het extravesiculaire medium en de inductie van peptide-membraaninteracties op de LUVs kunnen dus op een dosisafhankelijke manier een significante toename van fluorescentie veroorzaken die een lekkage onthult. Voorbeelden worden hier gegeven met de recent ontwikkelde tryptofaan (W) – en arginine (R) -rijke amphipathische peptiden (WRAPs), die een snelle en efficiënte siRNA-afgifte in verschillende cellijnen vertoonden. Ten slotte worden de aard van deze interacties en de affiniteit voor lipiden besproken om de membraantranslocatie en / of de endosomale ontsnapping te begrijpen en te verbeteren.
Introduction
Na hun ontdekking in de jaren negentig werden cel-penetrerende peptiden (CPP’s) ontwikkeld om een efficiënte cellulaire levering van ladingen door het plasmamembraan te bevorderen1,2. CPP’s zijn meestal korte peptiden, over het algemeen 8 tot 30 aminozuren, met een grote verscheidenheid aan oorsprongen. Ze werden voor het eerst gedefinieerd als “direct-translocerende” dragers, wat betekent dat ze in staat waren om het plasmamembraan te passeren en een lading over te brengen in cellen onafhankelijk van een endocytotische route, noch energiebehoefte noch receptorbetrokkenheid. Verder onderzoek bracht echter aan het licht dat deze eerste waarnemingen voornamelijk afkomstig waren van fluorescentieoverschatting als gevolg van het experimentele artefact en /of fixatieprotocollen met methanol3. Tegenwoordig is het algemeen aanvaard dat CPP-opname plaatsvindt door zowel endocytose als energie-onafhankelijke translocatie4,5,6,7, afhankelijk van verschillende parameters zoals de aard van de lading, de gebruikte link tussen CPP en lading, de bestudeerde cellijn, enz.
CPP’s kunnen worden gebruikt als transfectionerende middelen volgens twee strategieën, hetzij met een chemische link (covalente strategie) of elektrostatische / hydrofobe interacties (niet-covalente strategie) tussen de CPP en zijn lading8,9,10,11. Hoewel beide strategieën hun efficiëntie hebben aangetoond in de celoverdracht van verschillende ladingen, is het begrip van het mechanisme van internalisatie door CPP’s nog steeds controversieel en is de balans tussen endocytoseroutes of directe penetratie nog steeds moeilijk te meten12,13. Hoewel er een reeks experimentele hulpmiddelen en strategieën beschikbaar zijn om de betrokkenheid van endocytische processen duidelijk aan te pakken, lijkt de directe translocatie echter moeilijker te karakteriseren omdat het meer discrete interacties met plasmamembraancomponenten impliceert. Biologische membranen zijn meestal samengesteld uit talrijke componenten, van fosfolipiden tot membraaneiwitten, die kunnen variëren afhankelijk van het cellulaire type en / of de omgeving (stressomstandigheden, celdeling, enz.). Deze diversiteit van samenstelling, en bijgevolg de afwezigheid van een universeel cellulair membraanmodel, maakt studies op geen enkele manier mogelijk. Om deze beperkingen te omzeilen werden echter stapsgewijze benaderingen ontwikkeld met kunstmatige membraan- of membraanextracten. Van kleine unilamellaire blaasjes tot monolaagbenaderingen, elk model was duidelijk relevant om specifieke vragen14,15te beantwoorden. Onder hen vormen grote unilamellaire blaasjes (LUV’s) een geschikt membraanimmickmodel om peptide / membraaninteracties te bestuderen als een belangrijk punt in het internalisatieproces.
In deze context beschrijft het volgende protocol het onderzoek naar de effecten van peptiden en peptide/membraaninteracties op de integriteit van LUVs door de monitoring van zowel een anionische fluorescerende kleurstof als de bijbehorende poly-kationische quencher ingekapseld in liposomen. Deze tool wordt gebruikt om CPP/membraaninteracties te bestuderen om te begrijpen of ze in staat zijn om een directe membraantranslocatie uit te voeren. Hoewel deze LUV-fluorescentielekkagetest meestal wordt toegepast om verschillende membraan-interagerende peptiden te vergelijken, kan deze LUV-fluorescentielekkagetest ook worden gebruikt voor het onderzoeken van zowel CPPs-ladingconjugaten (covalente strategie) als CPP:cargo-complexen (niet-covalente strategie).
Het huidige protocol zal daarom voor het eerst worden geïllustreerd met de recent ontwikkelde tryptofaan (W) – en arginine (R) -rijke amphipathische peptiden (WRAP)16. WRAP is in staat om op peptiden gebaseerde nanodeeltjes te vormen om snel en efficiënt klein storend RNA (siRNA) in verschillende cellijnen af te leveren16. De fluorescentielekkage-eigenschappen van WRAP-peptide alleen of siRNA-geladen WRAP-gebaseerde nanodeeltjes werden gecontroleerd om hun mechanisme van cellulaire internalisatie te karakteriseren. We toonden aan dat hun mechanisme van internalisatie voornamelijk directe translocatiebetrof 7. In een tweede voorbeeld werd het WRAP-peptide covalent geconjugeerd aan het eiwit/ eiwitinterfererende peptide iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 en het vermogen om membranen te destabiliseren werd in een fluorescentielekkagetest vergeleken met iCAL36 gekoppeld aan Penetratine18 (Penetratin-iCAL36), een andere CPP.
Tot slot zullen de voor- en nadelen van de methode worden besproken, zowel vanuit technologisch oogpunt als met betrekking tot biologische relevantie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde fluorescentielekkagetest is een eenvoudige en snelle methode om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide aan te pakken. Het is gemakkelijk te doen en maakt ook een indirecte vergelijking mogelijk tussen verschillende membraan-interagerende peptiden of andere membraan-interagerende moleculen. Met betrekking tot kritieke stappen van het protocol, aangezien deze test relatieve waarden oplevert tussen de uitgangswaarde (alleen LUVs) en maximale fluorescentieafgifte (Triton-toestand), evalueren w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Emilie Josse bedanken voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de stichting “La Ligue contre le Cancer”, de “Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer” en het “Centre National de la Recherche Scientifique” (CNRS).
Materials
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
References
- Langel, U. . Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
- Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
- Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
- Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Jiao, C. -. Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
- Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).
- Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
- Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
- Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
- Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
- Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
- Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
- Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently “Wrap ‘n Roll” siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
- Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
- Notman, R., Noro, M., O’Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
- Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).
- Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).
- Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, &. #. 2. 2. 0. ;., Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
- Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).
- Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers – the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
- Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
- Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
- Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
- Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).
- Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
- Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
- van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292 (2010).
- Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
- Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).
- Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).
