فحص التسرب الفلوري للتحقيق في زعزعة استقرار الغشاء عن طريق الببتيد المخترق للخلايا
Summary
إن المقايسة الفلورية للتسرب هي طريقة بسيطة تمكن من التحقيق في تفاعلات الببتيد / الغشاء من أجل فهم مشاركتها في العديد من العمليات البيولوجية وخاصة قدرة الببتيدات المخترقة للخلايا على إزعاج الطبقات الثنائية الفوسفوليبيدات أثناء عملية نقل خلوية مباشرة.
Abstract
تعرف الببتيدات المخترقة للخلايا بأنها حاملات قادرة على عبور غشاء البلازما ونقل شحنة إلى خلايا. واحدة من السمات المشتركة الرئيسية المطلوبة لهذا النشاط نتج عن تفاعلات CPPs مع غشاء البلازما (الدهون) وبشكل خاص مع مكونات المصفوفة خارج الخلية من الغشاء نفسه (كبريتات الهيبران). في الواقع ، بغض النظر عن النقل المباشر أو الاستيعاب المعتمد على الإندوسيتوسيس ، تشارك الطبقات ثنائية الدهون في عملية الاستيعاب على مستوى غشاء البلازما وعلى مستوى حركة المرور داخل الخلايا (الحويصلات الداخلية). في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل يصف الخطوات المختلفة لصياغة الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs) ، وتنقية ، وتوصيف ، وتطبيق في مطهر التسرب الفلوري من أجل الكشف عن احتمال CPP – غشاء زعزعة الاستقرار / التفاعل ومعالجة دورها في آلية الاستيعاب. يتم إنشاء LUVs مع تكوين الدهون التي تعكس محتوى غشاء البلازما من أجل تغليف كل من صبغة الفلورسنت وquencher. إضافة الببتيدات في الوسط خارج الخصية وتحريض التفاعلات الببتيد الغشاء على LUVs وبالتالي قد تحفز بطريقة تعتمد على الجرعة زيادة كبيرة في الفلورسينس الكشف عن تسرب. وترد أمثلة هنا مع التربتوفان (W) التي تم تطويرها مؤخرا- وأرجينين (R) الغنية الببتيدات Amphipathic (WRAPs)، والتي أظهرت تسليم سيرنا سريعة وفعالة في خطوط الخلايا المختلفة. وأخيرا، تتم مناقشة طبيعة هذه التفاعلات وتقارب الدهون لفهم وتحسين نقل الغشاء و / أو الهروب الاندوسومالي.
Introduction
بعد اكتشافها في التسعينات ، تم تطوير الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) لتعزيز التسليم الخلوي الفعال للشحنات من خلال غشاء البلازما1،2. CPPs عادة ما تكون الببتيدات قصيرة، عموما 8 إلى 30 الأحماض الأمينية، وجود مجموعة واسعة من الأصول. وقد تم تعريفها لأول مرة على أنها حاملات “مباشرة النقل”، مما يعني أنها كانت قادرة على عبور غشاء البلازما ونقل شحنة إلى خلايا بشكل مستقل عن أي مسار داخليا لا متطلبات الطاقة ولا مشاركة المستقبلات. ومع ذلك، كشفت تحقيقات أخرى أن هذه الملاحظات الأولى جاءت أساسا من المبالغة في تقدير الفلورية بسبب القطع الأثرية التجريبية و / أو بروتوكولات التثبيت باستخدام الميثانول3. في الوقت الحاضر ، من المقبول على نطاق واسع أن امتصاص CPP يحدث عن طريق كل من الاندوكيتوسيس ونقل الطاقةالمستقلة 4و5و6و7 اعتمادا على معلمات مختلفة مثلطبيعة الشحنة ، والصلة المستخدمة بين CPP والبضائع ، وخط الخلية المدروس ، وما إلى ذلك.
يمكن استخدام CPPs كعوامل العدوى وفقا لاستراتيجيتين ، إما تنطوي على وصلة كيميائية (استراتيجية التكافؤ) أو التفاعلات الكهربائية / الكارهة للماء (استراتيجية غير التكافؤ) بين CPP وحمولتها8و9و10و11. على الرغم من أن كلا الاستراتيجيتين أظهرتا كفاءتهما في نقل الخلايا لعدة شحنات ، إلا أن فهم آلية الاستيعاب من قبل CPPs لا يزال موضع جدل ولا يزال من الصعب قياس التوازن بين مسارات الغدد الصماء أو الاختراق المباشر12،13. على الرغم من توفر مجموعة من الأدوات والاستراتيجيات التجريبية لمعالجة مشاركة العمليات الاندوستيكية بوضوح ، إلا أن النقل المباشر يبدو أكثر صعوبة في توصيفه لأنه ينطوي على تفاعلات أكثر تميزا مع مكونات غشاء البلازما. تتكون الأغشية البيولوجية عادة من مكونات عديدة ، من الفوسفوليبيدات إلى بروتينات الأغشية ، والتي قد تختلف وفقا لنوع الخلية و / أو البيئة (ظروف الإجهاد ، انقسام الخلايا ، وما إلى ذلك). هذا التنوع في التركيب ، وبالتالي عدم وجود نموذج عالمي للغشاء الخلوي لا يمكن من إجراء الدراسات بطريقة واحدة. ومع ذلك ، للتحايل على هذه القيود تم تطوير نهج خطوة بخطوة مع الغشاء الاصطناعي أو مقتطفات الغشاء. من الحويصلات unilamellar الصغيرة لنهج أحادية الطبقة، وكان كل نموذج ذات الصلة بوضوح للإجابة على أسئلة محددة14،15. من بينها ، تشكل الحويصلات الكبيرة unilamellar (LUVs) نموذجا مناسبا لمحاكاة الأغشية لدراسة تفاعلات الببتيد / الغشاء كنقطة رئيسية في عملية الاستيعاب.
وفي هذا السياق، يصف البروتوكول التالي التحقيق في آثار الببتيدات وتفاعلات الببتيد/الغشاء على سلامة المركبات من خلال رصد كل من صبغة فلورية أنيونية وما يقابلها من كمية من الكوينشر متعدد cationic مغلفة في الليبوسومات. تستخدم هذه الأداة لدراسة تفاعلات CPP/Membrane من أجل فهم ما إذا كانت قادرة على إجراء نقل مباشر للغشاء. على الرغم من تطبيقها عادة لمقارنة الببتيدات المختلفة المتفاعلة مع الأغشية ، يمكن أيضا استخدام هذا المقايسة التسرب الفلوري LUV للتحقيق في كل من المواكب CPPs-cargo (الاستراتيجية التساهمية) وCPP: مجمعات الشحن (استراتيجية غير التكافؤ).
ومن ثم فإن البروتوكول الحالي سيكون أول مثال مع التربتوفان (W) التي تم تطويرها مؤخرا – وأرجينين (R) الغنية الببتيدات Amphipathic (WRAP)16. WRAP قادرة على تشكيل الجسيمات النانوية القائمة على الببتيد لتقديم بسرعة وكفاءة الجيش الملكي النيبالي التدخل الصغيرة (siRNA) في عدة خطوط الخلية16. تم رصد خصائص تسرب الفلورية من الببتيد WRAP وحدها أو الجسيمات النانوية المستندة إلى التفاف محملة siRNA لتوصيف آلية الاستيعاب الخلوية الخاصة بهم. أظهرنا أن آلية الاستيعاب الخاصة بهم تنطوي بشكل رئيسي على النقل المباشر7. في مثال ثان، تم اقتران الببتيد WRAP بشكل متناقض مع البروتين / البروتين التدخل الببتيد iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 وقورنت قدرته على زعزعة استقرار الأغشية في مقايسة تسرب مضان إلى iCAL36 إلى جانب Penetratin18 (Penetratin-iCAL36)، وهو CPP آخر.
وأخيرا، ستناقش مزايا هذه الطريقة وحدودها من وجهة نظر تكنولوجية وفيما يتعلق بالأهمية البيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن المقايسة المقدمة لتسرب الفلورسينس هي طريقة بسيطة وسريعة لمعالجة زعزعة استقرار الأغشية عن طريق الببتيد المخترق للخلايا. من السهل القيام به ، كما أنه يتيح مقارنة غير مباشرة بين الببتيدات المختلفة التي تتفاعل مع الأغشية أو الجزيئات الأخرى المتفاعلة مع الأغشية. وفيما يتعلق بالخطوات الحا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا إيميلي جوس على المراجعة النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل مؤسسة “La Ligue contre le Cancer”، و”مؤسسة ARC من أجل إعادة التشبيه في السرطان”، و”المركز الوطني للبحوث العلمي”.
Materials
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
References
- Langel, U. . Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
- Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
- Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
- Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Jiao, C. -. Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
- Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).
- Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
- Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
- Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
- Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
- Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
- Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
- Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently “Wrap ‘n Roll” siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
- Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
- Notman, R., Noro, M., O’Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
- Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).
- Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).
- Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, &. #. 2. 2. 0. ;., Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
- Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).
- Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers – the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
- Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
- Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
- Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
- Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).
- Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
- Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
- van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292 (2010).
- Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
- Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).
- Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).
