Uso de la inmunofluorescencia para detectar el daño al ADN inducido por PM2.5en corazones de embriones de pez cebra
Summary
Este protocolo utiliza un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño en el ADN inducido por PM2.5en los corazones disecados de embriones de pez cebra.
Abstract
La exposición a partículas finas ambientales (PM2.5)puede conducir a toxicidad para el desarrollo cardíaco, pero los mecanismos moleculares subyacentes aún no están claros. La 8-hidroxi-2’desoxigenasa (8-OHdG) es un marcador de daño oxidativo del ADN y γH2AX es un marcador sensible para las roturas de doble cadena del ADN. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar cambios en PM2.5-inducidos por 8-OHdG y γH2AX en el corazón de embriones de pez cebra utilizando un ensayo de inmunofluorescencia. Los embriones de pez cebra fueron tratados con materia orgánica extraíble (EOM) a partir de PM2.5 a 5 μg/mL en presencia o ausencia de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0.25 μM) a las 2 h después de la fertilización (hpf). DMSO se utilizó como control de vehículos. A 72 hpf, los corazones se diseccionaron de embriones usando una aguja de jeringa y se fijaron y permeabilizaron. Después de ser bloqueadas, las muestras fueron sondeada con anticuerpos primarios contra 8-OHdG y γH2AX. Las muestras se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios. Las imágenes resultantes se observaron bajo microscopía de fluorescencia y se cuantificaron utilizando ImageJ. Los resultados muestran que la OMA de PM2.5 mejoró significativamente las señales 8-OHdG y γH2AX en el corazón de los embriones de pez cebra. Sin embargo, NAC, actuando como un eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS), contrarrestó parcialmente el daño del ADN inducido por la OMA. Aquí, presentamos un protocolo de inmunofluorescencia para investigar el papel del daño en el ADN en los defectos cardíacos inducidos por PM2.5que se pueden aplicar a la detección de cambios en la expresión de proteínas inducidas por químicos ambientales en los corazones de embriones de pez cebra.
Introduction
La contaminación del aire es ahora un grave problema ambiental que enfrenta el mundo. Las partículas finas ambientales (PM2.5),que es uno de los indicadores más importantes de la calidad del aire, pueden transportar una gran cantidad de sustancias nocivas y entrar en el sistema circulatorio de la sangre, causando graves daños a la salud humana1. Los estudios epidemiológicos han demostrado que la exposición a PM2.5 puede conducir a un mayor riesgo de defectos cardíacos congénitos (CHD)2,3. La evidencia de experimentos con animales también mostró que PM2.5 puede causar un desarrollo cardíaco anormal en embriones de pez cebra y la descendencia de ratones, pero los mecanismos moleculares de la toxicidad del desarrollo cardíaco de PM2.5 aún se desconocen en gran medida4,5,6.
El daño en el ADN puede causar la detención del ciclo celular e inducir apoptosis, lo que puede destruir ampliamente el potencial de las células progenitoras y, en consecuencia, afectar el desarrollo del corazón7). Se ha documentado bien que los contaminantes ambientales, incluyendo PM2.5,tienen el potencial de atacar el ADN a través de mecanismos de estrés oxidativo8,9. Tanto el desarrollo cardíaco humano como el pez cebra son sensibles al estrés oxidativo10,11,12. 8-OHdG es un marcador de daño oxidativo del ADN, y la señal γH2AX es un marcador de roturas de doble cadena de ADN. La N-acetil-L-cisteína (NAC), un precursor sintético de la cisteína intracelular y el glutatión, es ampliamente utilizado como compuesto antioxidante. En este estudio, utilizamos NAC para investigar el papel del estrés oxidativo en PM2.5– daño inducido por el ADN13.
El pez cebra como vertebrado modelo ha sido ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo cardíaco y las enfermedades cardiovasculares humanas porque los mecanismos del desarrollo cardíaco están altamente conservados entre los vertebrados14,15. Las ventajas de usar el pez cebra como modelo incluyen su pequeño tamaño, fuerte capacidad reproductiva y bajo costo de alimentación. De particular interés para estos estudios, los embriones de pez cebra no dependen del sistema circulatorio durante el desarrollo temprano y pueden sobrevivir a una malformación cardíaca grave14. Además, su transparencia permite observar directamente todo el cuerpo bajo un microscopio. Por lo tanto, los embriones de pez cebra brindan una excelente oportunidad para evaluar los mecanismos moleculares involucrados en la inducción de la toxicidad del desarrollo cardíaco como resultado de la exposición a diversos productos químicos ambientales5,16,17. Hemos informado previamente que el estrés oxidativo inducido por PM2.5conduce al daño del ADN y la apoptosis, lo que resulta en malformaciones cardíacas en el pez cebra18. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para investigar el daño al ADN inducido por PM2.5en el corazón de embriones de pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque el pez cebra es un excelente modelo de vertebrados para estudiar la toxicidad del desarrollo cardíaco de los productos químicos ambientales, debido al pequeño tamaño del corazón embrionario, es difícil obtener suficiente proteína para el análisis de western blot. Por lo tanto, presentamos un método de inmunofluorescencia sensible para cuantificar los niveles de expresión de proteínas de los biomarcadores de daño al ADN en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a PM2.5.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (número de subvención: 81870239, 81741005, 81972999) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
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