Usando imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5em corações embrionários de zebrafish
Summary
Este protocolo usa um ensaio de imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5nos corações dissecados de embriões de zebrafish.
Abstract
A exposição de partículas finas ambientes (PM2.5) pode levar à toxicidade do desenvolvimento cardíaco, mas os mecanismos moleculares subjacentes ainda não estão claros. 8-hidroxi-2’desoxygenase (8-OHdG) é um marcador de dano oxidativo de DNA e γH2AX é um marcador sensível para quebras de fios duplos de DNA. Neste estudo, tivemos como objetivo detectar alterações de PM2.5-Induzidas 8-OHdG e γH2AX no coração de embriões de zebrafish usando um ensaio de imunofluorescência. Os embriões de zebrafish foram tratados com questões orgânicas extrativáveis (EOM) a partir de PM2,5 a 5 μg/mL na presença ou ausência de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0,25 μM) a 2 h pós fertilização (hpf). O DMSO foi usado como controle de veículos. Com 72 cv, os corações foram dissecados a partir de embriões usando uma agulha de seringa e fixos e permeabilizados. Após serem bloqueadas, as amostras foram sondadas com anticorpos primários contra 8-OHdG e γH2AX. As amostras foram então lavadas e incubadas com anticorpos secundários. As imagens resultantes foram observadas sob microscopia de fluorescência e quantificadas por ImageJ. Os resultados mostram que os sinais de EOM de PM2.5 aumentaram significativamente os sinais 8-OHdG e γH2AX no coração dos embriões de zebrafish. No entanto, o NAC, agindo como um carniceiro reativa de oxigênio (ROS), contra-ativou parcialmente o dano de DNA induzido pelo EOM. Aqui, apresentamos um protocolo de imunofluorescência para investigar o papel dos danos de DNA em defeitos cardíacos induzidos por PM2,5que podem ser aplicados à detecção de mudanças de expressão de proteínas induzidas por químicos ambientais nos corações dos embriões de zebrafish.
Introduction
A poluição do ar é agora um sério problema ambiental enfrentado pelo mundo. Partículas finas ambientes (PM2.5),que é um dos indicadores mais importantes da qualidade do ar, podem transportar um grande número de substâncias nocivas e entrar no sistema circulatório sanguíneo, causando sérios danos à saúde humana1. Estudos epidemiológicos demonstraram que a exposição à PM2,5 pode levar a um risco aumentado de defeitos cardíacos congênitos (CHDs)2,3. Evidências de experimentos em animais também mostraram que a PM2.5 pode causar desenvolvimento cardíaco anormal em embriões de zebrafish e na prole de camundongos, mas os mecanismos moleculares da toxicidade do desenvolvimento cardíaco de PM2.5 ainda são amplamente desconhecidos4,5,6.
Danos no DNA podem causar apreensão do ciclo celular e induzir apoptose, que pode destruir extensivamente o potencial das células progenitoras e, consequentemente, prejudicar o desenvolvimento cardíaco7). Foi bem documentado que os poluentes ambientais, incluindo o PM2.5,têm potencial para atacar o DNA através de mecanismos de estresse oxidativo8,9. Tanto o desenvolvimento cardíaco humano quanto o zebrafish são sensíveis ao estresse oxidativo10,11,12. 8-OHdG é um marcador de dano de DNA oxidativo, e o sinal γH2AX é um marcador de quebras duplas de dna. N-acetil-L-cisteína (NAC), um precursor sintético de cisteína intracelular e glutationa, é amplamente utilizado como um composto antioxidante. Neste estudo, utilizamos o NAC para investigar o papel do estresse oxidativo na PM2.5– dano de DNA induzido13.
O zebrafish como vertebrado modelo tem sido amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento cardíaco e doenças cardiovasculares humanas porque os mecanismos de desenvolvimento cardíaco são altamente conservados entre vertebrados14,15. As vantagens de usar o zebrafish como modelo incluem seu pequeno tamanho, forte capacidade reprodutiva e baixo custo de alimentação. De particular interesse para esses estudos, os embriões de zebrafish não dependem do sistema circulatório durante o desenvolvimento precoce e podem sobreviver à malformação cardíaca grave14. Além disso, sua transparência permite que todo o corpo seja diretamente observado sob um microscópio. Assim, os embriões de zebrafish proporcionam uma excelente oportunidade para avaliar os mecanismos moleculares envolvidos na indução da toxicidade do desenvolvimento cardíaco como resultado da exposição a diversos produtos químicos ambientais5,16,17. Informamos anteriormente que o estresse oxidativo induzido por PM2.5leva a danos no DNA e à apoptose, resultando em malformações cardíacas em zebrafish18. Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado para investigar danos de DNA induzidos por PM2.5no coração de embriões de zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora o zebrafish seja um excelente modelo vertebrado para estudar a toxicidade do desenvolvimento cardíaco de produtos químicos ambientais, devido ao pequeno tamanho do coração embrião, é difícil obter proteína suficiente para análise de manchas ocidentais. Por isso, apresentamos um método sensível de imunofluorescência para quantificar os níveis de expressão proteica dos biomarcadores de dano de DNA nos corações dos embriões de zebrafish expostos à PM2.5.
Durant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências da Natureza da China (número de subvenção: 81870239, 81741005, 81972999) e pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
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