Utilizzo dell'immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM2,5nei cuori embrionali di zebrafish
Summary
Questo protocollo utilizza un test di immunofluorescenza per rilevare danni al DNA indotti da PM2,5nei cuori sezionati degli embrioni di zebrafish.
Abstract
L’esposizione al particolato fine ambientale (PM2,5)può portare a tossicità per lo sviluppo cardiaco, ma i meccanismi molecolari sottostanti non sono ancora chiari. L’8-idrossi-2’deossigenasi (8-OHdG) è un marker del danno ossidativo al DNA e γH2AX è un marcatore sensibile per le rotture del doppio filamento del DNA. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare i cambiamenti 8-OHdG eγH2AXindotti da PM 2,5 nel cuore degli embrioni di zebrafish utilizzando un test di immunofluorescenza. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con sostanze organiche estraibili (EOM) da PM2,5 a 5 μg/mL in presenza o assenza di N-acetil-L-cisteina antiossidante (NAC, 0,25 μM) a 2 ore dopo la fecondazione (hpf). DMSO è stato utilizzato come controllo del veicolo. A 72 hpf, i cuori sono stati sezionati dagli embrioni usando un ago a siringa e fissati e permeabilizzati. Dopo essere stati bloccati, i campioni sono stati sondati con anticorpi primari contro 8-OHdG e γH2AX. I campioni sono stati poi lavati e incubati con anticorpi secondari. Le immagini risultanti sono state osservate al microscopio a fluorescenza e quantificate utilizzando ImageJ. I risultati mostrano che EOM da PM2.5 ha migliorato significativamente i segnali 8-OHdG e γH2AX nel cuore degli embrioni di zebrafish. Tuttavia, NAC, agendo come spazzino di specie reattive dell’ossigeno (ROS), ha parzialmente contrastato il danno al DNA indotto dall’EOM. Qui, presentiamo un protocollo di immunofluorescenza per studiare il ruolo del danno al DNA nei difetti cardiaci indotti da PM2,5che possono essere applicati al rilevamento di cambiamenti di espressione proteica indotti da sostanze chimiche ambientali nei cuori degli embrioni di zebrafish.
Introduction
L’inquinamento atmosferico è ora un grave problema ambientale che il mondo deve affrontare. Il particolato fine ambientale (PM2,5), che è uno degli indicatori più importanti della qualità dell’aria, può trasportare un gran numero di sostanze nocive ed entrare nel sistema circolatorio del sangue, causando gravi danni alla salute umana1. Studi epidemiologici hanno dimostrato che l’esposizione al PM2,5 può portare ad un aumento del rischio di difetti cardiaci congeniti (CHD)2,3. Le prove degli esperimenti sugli animali hanno anche dimostrato che il PM2,5 può causare uno sviluppo cardiaco anormale negli embrioni di zebrafish e nella prole dei topi, ma i meccanismi molecolari della tossicità dello sviluppo cardiaco del PM2,5 sono ancora in gran parte sconosciuti4,5,6.
Il danno al DNA può causare l’arresto del ciclo cellulare e indurre l’apoptosi, che può distruggere ampiamente il potenziale delle cellule progenitrici e, di conseguenza, compromettere lo sviluppo del cuore7). È stato ben documentato che gli inquinanti ambientali, tra cui il PM2,5,hanno il potenziale di attaccare il DNA attraverso meccanismi di stress ossidativo8,9. Sia lo sviluppo cardiaco umano che quello del pesce zebra sono sensibili allo stress ossidativo10,11,12. 8-OHdG è un marcatore di danno ossidativo del DNA e il segnale γH2AX è un marcatore di rotture del doppio filamento di DNA. N-acetil-L-cisteina (NAC), un precursore sintetico della cisteina intracellulare e del glutatione, è ampiamente usato come composto antiossidante. In questo studio, utilizziamo NAC per indagare il ruolo dello stress ossidativo in PM2.5– danno al DNA indotto13.
Zebrafish come vertebrato modello è stato ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo cardiaco e le malattie cardiovascolari umane perché i meccanismi di sviluppo cardiaco sono altamente conservati tra i vertebrati14,15. I vantaggi dell’utilizzo del pesce zebra come modello includono le loro piccole dimensioni, la forte capacità riproduttiva e il basso costo di alimentazione. Di particolare interesse per questi studi, gli embrioni di zebrafish non dipendono dal sistema circolatorio durante lo sviluppo precoce e possono sopravvivere a gravi malformazioni cardiache14. Inoltre, la loro trasparenza consente di osservare direttamente l’intero corpo al microscopio. Pertanto, gli embrioni di zebrafish offrono un’eccezionale opportunità per valutare i meccanismi molecolari coinvolti nell’induzione della tossicità dello sviluppo cardiaco a seguito dell’esposizione a varie sostanze chimiche ambientali5,16,17. Abbiamo precedentemente riferito che lo stress ossidativo indotto da PM2,5porta a danni al DNA e apoptosi, con conseguenti malformazioni cardiache nel pesce zebra18. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato per indagare il danno al DNA indotto da PM2,5nel cuore degli embrioni di zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene il pesce zebra sia un eccellente modello di vertebrato per studiare la tossicità dello sviluppo cardiaco delle sostanze chimiche ambientali, a causa delle piccole dimensioni del cuore dell’embrione, è difficile ottenere abbastanza proteine per l’analisi western blot. Pertanto, presentiamo un metodo di immunofluorescenza sensibile per quantificare i livelli di espressione proteica dei biomarcatori di danno al DNA nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti a PM2.5.
Durant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Nature Sciences Foundation of China (numero di sovvenzione: 81870239, 81741005, 81972999) e the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
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