שימוש בחיסון כדי לזהות נזק לדנ"א2.5המושרה בלבבות העוברים של דגי הזברה
Summary
פרוטוקול זה משתמש ב בדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5בלבם הניתח של עוברים דגי זברה.
Abstract
חשיפה חלקיקית עדינה סביבתית (PM2.5)עלולה להוביל לרעילות התפתחותית של הלב, אך המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם ברורים. 8-הידרוקסי-2’deoxygenase (8-OHdG) הוא סמן של נזק DNA חמצוני ו γH2AX הוא סמן רגיש עבור שברי גדיל כפול DNA. במחקר זה, אנו שואפים לזהות PM2.5-המושרה 8-OHdG ו γH2AX שינויים בלב של עוברים דג זברה באמצעות בדיקת אימונופלואורסצנטיות. עוברים דגי זברה טופלו בעניינים אורגניים הניתנים לחילוץ (EOM) מ PM2.5 ב 5 מיקרוגרם / מ”ל בנוכחות או היעדר נוגד חמצון N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC, 0.25 מיקרומטר) ב 2 שעות לאחר ההפריה (hpf). DMSO שימש כפקד רכב. ב 72 כ”ס, לבבות נותחו מעוברים באמצעות מחט מזרק קבוע וחלחל. לאחר שנחסמו, דגימות נבדקו עם נוגדנים ראשוניים נגד 8-OHdG ו γH2AX. לאחר מכן נשטפו הדגימות ודגרו בנוגדנים משניים. התמונות שהתקבלו נצפו תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וכימותו באמצעות ImageJ. התוצאות מראות כי EOM מ PM2.5 משופר באופן משמעותי 8-OHdG ו γH2AX אותות בלב העוברים של דגי זברה. עם זאת, NAC, הפועל כנבלות חמצן תגובתי (ROS), נטרל חלקית את נזק ה- DNA שנגרם על ידי EOM. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסצנטיות לחקירת תפקידו של נזק לדנ”א ב- PM 2.5 – מומים בלב הנגרמים על ידי PM2.5שניתן להחיל על גילוי שינויים בביטוי חלבון סביבתי המושרה כימי בלבם של עוברים דגי זברה.
Introduction
זיהום אוויר הוא כיום בעיה סביבתית חמורה העומדת בפני העולם. חומר חלקיקי הסביבה בסדר (PM2.5), שהוא אחד האינדיקטורים החשובים ביותר של איכות האוויר, יכול לשאת מספר רב של חומרים מזיקים ולהיכנס למערכת הדם, גרימת נזק חמור לבריאותהאדם 1. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי חשיפה PM2.5 יכול להוביל לסיכון מוגבר של מומים מולדים בלב (CHDs)2,3. עדויות מניסויים בבעלי חיים הראו גם כי PM2.5 יכול לגרום להתפתחות לב חריגה בעוברי דגי זברה וצאצאים של עכברים, אבל המנגנונים המולקולריים של הרעילות ההתפתחותית הלבבית של PM2.5 עדיין לא ידוע במידה רבה4,5,6.
נזק לדנ”א יכול לגרום למעצר מחזור התא ולגרום לאפופטוזיס, אשר עלול להרוס בהרחבה את הפוטנציאל של תאים אבות, וכתוצאה מכך, לפגוע בהתפתחות הלב7). זה כבר מתועד היטב כי מזהמים סביבתיים, כולל PM2.5, יש פוטנציאל לתקוף DNA באמצעות מנגנוני עקה חמצונית8,9. הן התפתחות הלב האנושי והן של דג הזברה רגישים ללחץ חמצוני10,11,12. 8-OHdG הוא סמן נזק DNA חמצוני, ואות γH2AX הוא סמן של שברי גדיל כפול DNA. N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC), מבשר סינתטי של ציסטאין תאי וגלוטתיון, נמצא בשימוש נרחב כתרכובת נוגד חמצון. במחקר זה, אנו משתמשים NAC כדי לחקור את התפקיד של עקה חמצונית PM2.5– נזק DNA המושרה13.
דגי זברה כעליית חוליות מודל שימשו באופן נרחב לחקר התפתחות הלב ומחלות לב וכלי דם אנושיים מכיוון שמנגנונים של התפתחות הלב נשמרים מאוד בקרב בעלי חוליות14,15. היתרונות של שימוש בדגי זברה כמודל כוללים את גודלם הקטן, יכולת הרבייה החזקה ועלות האכלה נמוכה. עניין מיוחד במחקרים אלה, עוברים דג זברה אינם תלויים במערכת הדם במהלך ההתפתחות המוקדמת ויכולים לשרוד מום לב חמור14. יתר על כן, השקיפות שלהם מאפשרת את כל הגוף להיות נצפה ישירות תחת מיקרוסקופ. לכן, עוברים דגי זברה מספקים הזדמנות יוצאת דופן להערכת המנגנונים המולקולריים המעורבים בגיוס רעילות התפתחותית לבבית כתוצאה מחשיפה לכימיקלים סביבתיים שונים5,16,17. דיווחנו בעבר כי PM2.5– סטרס חמצוני המושרה מוביל לנזק DNA אפופטוזיס, וכתוצאה מכך מומים בלב דג זברה18. במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקירת נזק DNA המושרה PM2.5בלב העוברים של דגי זברה.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות דג זברה הוא מודל בעל חוליות מצוין לחקר הרעילות ההתפתחותית הלבבית של כימיקלים סביבתיים, בשל הגודל הקטן של הלב העובר, קשה להשיג מספיק חלבון לניתוח כתם מערבי. לכן, אנו מציגים שיטה חיסונית רגישה לכימות רמות ביטוי החלבון של סמנים ביולוגיים נזק DNA בלבם של עוברים דג זברה חשוף PM2.5.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 81870239, 81741005, 81972999) ופיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות ההשכלה הגבוהה בג’יאנגסו.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d’Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
