Utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre
Summary
Ce protocole utilise un test d’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs disséqués des embryons de poisson-zèbre.
Abstract
L’exposition aux particules fines ambiantes (PM2,5)peut entraîner une toxicité pour le développement cardiaque, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas encore clairs. La 8-hydroxy-2’désoxygénase (8-OHdG) est un marqueur des dommages oxydatifs à l’ADN et γH2AX est un marqueur sensible pour les cassures double brin de l’ADN. Dans cette étude, nous avons cherché à détecter les changements 8-OHdG etγH2AXinduits par les PM 2,5 au cœur des embryons de poisson-zèbre à l’aide d’un test d’immunofluorescence. Les embryons de poisson-zèbre ont été traités avec des matières organiques extractibles (EOM) de PM2,5 à 5 μg/mL en présence ou en l’absence d’antioxydant n-acétyl-L-cystéine (NAC, 0,25 μM) à 2 h après la fécondation (HPF). Le DMSO a été utilisé comme contrôle du véhicule. À 72 hpf, les cœurs ont été disséqués à partir d’embryons à l’aide d’une aiguille de seringue et fixés et perméabilisés. Après avoir été bloqués, les échantillons ont été sondés avec des anticorps primaires contre le 8-OHdG et l’γH2AX. Les échantillons ont ensuite été lavés et incubés avec des anticorps secondaires. Les images résultantes ont été observées en microscopie à fluorescence et quantifiées à l’aide d’ImageJ. Les résultats montrent que la MOE des PM2,5 a significativement amélioré les signaux 8-OHdG et γH2AX au cœur des embryons de poissons-zèbres. Cependant, le NAC, agissant comme un piégeur d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), a partiellement contrecarré les dommages à l’ADN induits par la MOE. Ici, nous présentons un protocole d’immunofluorescence pour étudier le rôle des dommages à l’ADN dans les malformations cardiaques induites par les PM2,5qui peuvent être appliqués à la détection des changements d’expression protéique induits par des produits chimiques environnementaux dans le cœur des embryons de poisson-zèbre.
Introduction
La pollution de l’air est aujourd’hui un grave problème environnemental auquel le monde est confronté. Les particules fines ambiantes (PM2,5),qui sont l’un des indicateurs les plus importants de la qualité de l’air, peuvent transporter un grand nombre de substances nocives et pénétrer dans le système circulatoire sanguin, causant de graves dommages à la santé humaine1. Des études épidémiologiques ont démontré que l’exposition aux PM2,5 peut entraîner un risque accru de malformations cardiaques congénitales (CHD)2,3. Les preuves provenant d’expériences animales ont également montré que les PM2,5 peuvent provoquer un développement cardiaque anormal chez les embryons de poisson-zèbre et la progéniture de souris, mais les mécanismes moléculaires de la toxicité pour le développement cardiaque des PM2,5 sont encore largement inconnus4,5,6.
Les dommages à l’ADN peuvent provoquer l’arrêt du cycle cellulaire et induire l’apoptose, ce qui peut détruire considérablement le potentiel des cellules progénitaires et, par conséquent, nuire au développement cardiaque7). Il a été bien documenté que les polluants environnementaux, y compris les PM2,5,ont le potentiel d’attaquer l’ADN par des mécanismes de stress oxydatif8,9. Le développement cardiaque humain et le poisson-zèbre sont sensibles au stress oxydatif10,11,12. Le 8-OHdG est un marqueur oxydatif de dommages à l’ADN, et le signal γH2AX est un marqueur des cassures double brin de l’ADN. La N-acétyl-L-cystéine (NAC), un précurseur synthétique de la cystéine intracellulaire et du glutathion, est largement utilisée comme composé antioxydant. Dans cette étude, nous utilisons le NAC pour étudier le rôle du stress oxydatif dans les dommages à l’ADN induits par les PM2,513.
Le poisson-zèbre en tant que vertébré modèle a été largement utilisé pour étudier le développement cardiaque et les maladies cardiovasculaires humaines, car les mécanismes du développement cardiaque sont très conservés chez les vertébrés14,15. Les avantages de l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle comprennent leur petite taille, leur forte capacité de reproduction et leur faible coût d’alimentation. D’un intérêt particulier pour ces études, les embryons de poisson zèbre ne dépendent pas du système circulatoire au cours du développement précoce et peuvent survivre à une malformation cardiaque grave14. De plus, leur transparence permet d’observer directement l’ensemble du corps au microscope. Ainsi, les embryons de poisson zèbre offrent une occasion exceptionnelle d’évaluer les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction de la toxicité pour le développement cardiaque à la suite de l’exposition à divers produits chimiquesenvironnementaux 5,16,17. Nous avons précédemment rapporté que le stress oxydatif induit par les PM2,5entraîne des dommages à l’ADN et l’apoptose, entraînant des malformations cardiaques chez le poisson-zèbre18. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé pour étudier les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans le cœur des embryons de poisson-zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que le poisson-zèbre soit un excellent modèle de vertébrés pour étudier la toxicité pour le développement cardiaque des produits chimiques environnementaux, en raison de la petite taille du cœur embryonnaire, il est difficile d’obtenir suffisamment de protéines pour l’analyse par transfert de Western. Par conséquent, nous présentons une méthode d’immunofluorescence sensible pour quantifier les niveaux d’expression protéique des biomarqueurs de dommages à l’ADN dans le cœur des embryons de po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences de la nature de Chine (numéro de subvention: 81870239, 81741005, 81972999) et le développement du programme académique prioritaire des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
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