Immunofluorescentie gebruiken om PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in zebravisembryoharten te detecteren
Summary
Dit protocol maakt gebruik van een immunofluorescentietest om PM2,5-geïnduceerdeDNA-schade in de ontlede harten van zebravisembryo’s te detecteren.
Abstract
Blootstelling aan fijnstof in de omgeving (PM2,5)kan leiden tot cardiale ontwikkelingstoxiciteit, maar de onderliggende moleculaire mechanismen zijn nog onduidelijk. 8-hydroxy-2’deoxygenase (8-OHdG) is een marker van oxidatieve DNA-schade en γH2AX is een gevoelige marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken. In deze studie wilden we PM2,5-geïnduceerde8-OHdG- en γH2AX-veranderingen in het hart van zebravisembryo’s detecteren met behulp van een immunofluorescentietest. Zebravisembryo’s werden behandeld met extraheerbare organische stoffen (EOM) van PM2,5 bij 5 μg / ml in de aan- of afwezigheid van antioxidant N-acetyl-L-cysteïne (NAC, 0,25 μM) 2 uur na bevruchting (hpf). DMSO werd gebruikt als voertuigbesturing. Bij 72 hpf werden harten met behulp van een spuitnaald van embryo’s ontleed en gefixeerd en gepermeabiliseerd. Na te zijn geblokkeerd, werden monsters onderzocht met primaire antilichamen tegen 8-OHdG en γH2AX. Monsters werden vervolgens gewassen en geïncubeerd met secundaire antilichamen. De resulterende beelden werden waargenomen onder fluorescentiemicroscopie en gekwantificeerd met behulp van ImageJ. De resultaten tonen aan dat EOM van PM2.5 8-OHdG- en γH2AX-signalen in het hart van zebravisembryo’s aanzienlijk verbeterde. NAC, dat optrad als een reactieve zuurstofsoort (ROS) aaseter, ging de door EOM geïnduceerde DNA-schade echter gedeeltelijk tegen. Hier presenteren we een immunofluorescentieprotocol voor het onderzoeken van de rol van DNA-schade in PM2.5-geïnduceerdehartafwijkingen die kunnen worden toegepast op de detectie van door chemicaliën geïnduceerde eiwitexpressieveranderingen in de harten van zebravisembryo’s.
Introduction
Luchtvervuiling is nu een ernstig milieuprobleem waarmee de wereld wordt geconfronteerd. Fijnstof in de omgeving (PM2,5), een van de belangrijkste indicatoren van de luchtkwaliteit, kan een groot aantal schadelijke stoffen vervoeren en de bloedsomloop binnendringen, waardoor de menselijke gezondheid ernstig wordt geschaad1. Epidemiologische studies hebben aangetoond dat blootstelling aan PM2,5 kan leiden tot een verhoogd risico op aangeboren hartafwijkingen (CHD’s)2,3. Bewijs uit dierproeven toonde ook aan dat PM2,5 abnormale cardiale ontwikkeling kan veroorzaken bij zebravisembryo’s en de nakomelingen van muizen, maar de moleculaire mechanismen van de cardiale ontwikkelingstoxiciteit van PM2,5 zijn nog grotendeels onbekend4,5,6.
DNA-schade kan celcyclusstilstand veroorzaken en apoptose veroorzaken, die het potentieel van voorlopercellen op grote schaal kan vernietigen en bijgevolg de hartontwikkeling kan schaden7). Het is goed gedocumenteerd dat milieuverontreinigende stoffen, waaronder PM2.5, het potentieel hebben om DNA aan te vallen via oxidatieve stressmechanismen8,9. Zowel de hartontwikkeling van mens als zebravis zijn gevoelig voor oxidatieve stress10,11,12. 8-OHdG is een oxidatieve DNA-schademarker en het γH2AX-signaal is een marker van DNA-dubbelstrengsbreuken. N-acetyl-L-cysteïne (NAC), een synthetische voorloper van intracellulaire cysteïne en glutathion, wordt veel gebruikt als een anti-oxidatieve verbinding. In deze studie gebruiken we NAC om de rol van oxidatieve stress in PM2.5– geïnduceerde DNA-schade13te onderzoeken.
Zebravis als modelgewerveld dier is op grote schaal gebruikt om cardiale ontwikkeling en menselijke hart- en vaatziekten te bestuderen, omdat mechanismen van cardiale ontwikkeling zeer geconserveerd zijn bij gewervelde dieren14,15. De voordelen van het gebruik van zebravissen als model zijn hun kleine formaat, sterk voortplantingsvermogen en lage voedingskosten. Van bijzonder belang voor deze studies, zebravisembryo’s zijn niet afhankelijk van de bloedsomloop tijdens de vroege ontwikkeling en kunnen ernstige hartmisvorming overleven14. Bovendien maakt hun transparantie het mogelijk om het hele lichaam direct onder een microscoop te observeren. Zebravisembryo’s bieden dus een uitstekende gelegenheid voor het beoordelen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de inductie van cardiale ontwikkelingstoxiciteit als gevolg van blootstelling aan verschillende milieuchemicaliën5,16,17. We hebben eerder gemeld dat PM2.5-geïnduceerde oxidatieve stress leidt tot DNA-schade en apoptose, wat resulteert in hartmisvormingen bij zebravissen18. In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in het hart van zebravisembryo’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel zebravis een uitstekend gewerveld model is voor het bestuderen van de cardiale ontwikkelingstoxiciteit van milieuchemicaliën, is het vanwege de kleine omvang van het embryohart moeilijk om voldoende eiwit te verkrijgen voor western blot-analyse. Daarom presenteren we een gevoelige immunofluorescentiemethode voor het kwantificeren van de eiwitexpressieniveaus van DNA-schadebiomarkers in de harten van zebravisembryo’s die zijn blootgesteld aan PM2.5.
Tijdens dissectie is het b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Nature Sciences Foundation of China (subsidienummer: 81870239, 81741005, 81972999) en The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d’Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
