Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi
Summary
Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.
Abstract
Mitokondriler, aerobik solunum yapabilen ökaryotik hücrelerin temel organelleridir. Dairesel genom ve gen ifade aparatı içerirler. Fırıncı mayasının mitokondriyal genomları sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enzimi, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p’nin bir alt bölümüdür. Burada açıklanan yöntemin amacı, bu proteinleri özellikle 35S metiyonin ile etiketlemek, elektroforez ile ayırmak ve sinyalleri ekranda ayrık bantlar olarak görselleştirmektir. Yordam birkaç adım içerir. İlk olarak, maya hücreleri geç logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar galaktoz içeren bir ortamda kültürlenir. Daha sonra, sikloeximide tedavisi sitoplazmik çeviriyi engeller ve sadece mitokondriyal çeviri ürünlerinde 35S metiyonin birleştirilmesine izin verir. Daha sonra, tüm proteinler maya hücrelerinden çıkarılır ve poliakrilamid jel elektroforez ile ayrılır. Son olarak, jel kurutulur ve depolama fosfor ekranı ile inkübe edilir. Ekran, bantları ortaya çıkaran bir fosforimager üzerinde taranır. Yöntem, bir mutant maya suşunun mitokondrilerindeki tek bir polipeptitin biyosentez oranını, mitokondriyal gen ekspresyon kusurlarını incelemek için yararlı olan vahşi tiple karşılaştırmak için uygulanabilir. Bu protokol, tüm maya mitokondriyal mRNA’ların çeviri oranı hakkında değerli bilgiler verir. Bununla birlikte, uygun sonuçlara varmak için çeşitli kontroller ve ek deneyler gerektirir.
Introduction
Mitokondriler, ökaryotik bir hücrenin metabolizmasında derinden yer alan organellerdir. Elektron transfer zincirleri hücreye birden fazla biyokimyasal yolda kullanılan ana enerjik para birimi olan ATP’yi sağlar. Ayrıca, apoptoz, yağ asidi ve heme sentezi ve diğer süreçlerde yer almaktadırlar. Mitokondri disfonksiyonu iyi bilinen bir insan hastalığı kaynağıdır1. Organellerin yapısal veya düzenleyici bileşenlerini kodlayan nükleer veya mitokondriyal genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanabilir2. Fırıncı mayası Saccharomyces cerevisiae, çeşitli nedenlerden dolayı mitokondriyal gen ekspresyonunu incelemek için mükemmel bir model organizmadır. İlk olarak, genomları tamamensıralanmıştır 3, iyi açıklamalı ve bu organizma ile yürütülen uzun araştırma geçmişi sayesinde literatürde büyük miktarda veri zaten mevcuttur. İkincisi, nükleer genomları ile yapılan manipülasyonlar, hızlı büyüme hızları ve yüksek verimli homolog rekombinasyon sistemleri nedeniyle nispeten hızlı ve kolaydır. Üçüncüsü, fırıncı mayası S. cerevisiae, mitokondriyal genomlarla manipülasyonların geliştirildiği birkaç organizmadan biridir. Son olarak, fırıncı mayası, fermente edilebilir karbon kaynakları içeren medyada büyüyebilecekleri için solunum kusurlu mutantların izolasyonu ve incelenmesine izin veren aerobe-anaerobe öğretim üyesi bir organizmadır.
Çeviridüzeyindebaker mayası S. cerevisiae’nin mitokondriyal gen ekspresyonunu inceleme yöntemini açıklıyoruz. Ana prensibi çeşitli gözlemlerden gelir. İlk olarak, maya mitokondriyal genom sadece sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enziminin bir alt bölümü, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p5. Bu sayı küçüktür ve hepsi uygun koşullarda tek bir jel üzerinde elektroforezi ile ayrılabilir. İkincisi, mitokondriyal ribozomlar ökaryotik6yerine prokaryotik sınıfa aittir ve bu nedenle maya sitoplazmik ve mitokondriyal ribozomlar için antibiyotiklere duyarlılık farklıdır. Etiketli amino asidin(35S-metiyonin) sadece mitokondriyal çeviri ürünlerine dahil edildiği koşulları sağlayarak sikloseksüel ile sitoplazmik çevirinin inhibisyonunu sağlar. Sonuç olarak, deney, sekiz ürünün her biri için mitokondriyal çevirinin genel verimliliğini yansıtan, sentezlenen de novo sentezlenen mitokondriyal proteinlerde amino asit indüklenme oranı hakkında bilgi verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gen ekspresyasyonu incelemeleri modern yaşam bilimlerinde merkezi bir yer kaplar. Bu karmaşık süreç hakkında fikir veren çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. Burada, fırıncı mayası S. cerevisiae mitokondrisinde protein biyosentezine erişmeye izin verme yöntemini tanımladık. Genellikle mutant maya suşunun mitokondrilerindeki mRNA’ların çeviri verimliliklerini, çalışılan mutasyonun sonuçlarına erişmek için vahşi tipe karşı karşılaştırmak için uygulanır. Bu, araştırmacıları…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, 18-29-07002 numaralı Hibe numarası olan Rusya Temel Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi. P.K., Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı Devlet Ataması, AAAA-A16-116021660073-5 hibe numarası ile desteklendi. M.V.P., Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı tarafından 075-15-2019-1659 (Kurchatov Genom Araştırmaları Merkezi Programı) hibe numarası ile desteklendi. Çalışma kısmen Moskova Devlet Üniversitesi Kalkınma Programı çerçevesinde satın alınan ekipmanlar üzerinde yapıldı. I.C., S.L., ve M.V.B. ayrıca Moskova Devlet Üniversitesi tarafından “Önde Gelen Bilim Okulu Nuh’un Gemisi” tarafından desteklendi.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-563 (1996).
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
