Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

Las mitocondrias son los orgánulos profundamente involucrados en el metabolismo de una célula eucariota. Su cadena de transferencia de electrones suministra a la célula ATP, la principal moneda energética utilizada en múltiples vías bioquímicas. Además, están involucrados en apoptosis, síntesis de ácidos grasos y hemo, y otros procesos. La disfunción de las mitocondrias es una fuente bien conocida de la enfermedad humana^1. Puede ser el resultado de mutaciones en genes nucleares o mitocondriales que codifican componentes estructurales o reglamentarios de los orgánulos^2. La levadura saccharomyces cerevisiae de Baker es un excelente organismo modelo para estudiar la expresión génica mitocondrial debido a varias razones. En primer lugar, su genoma está completamente secuenciado^3,bien anotado, y una gran suma de datos ya está disponible en la literatura gracias a la larga historia de investigaciones llevadas a cabo con este organismo. En segundo lugar, las manipulaciones con su genoma nuclear son relativamente rápidas y fáciles debido a su rápida tasa de crecimiento y su sistema de recombinación homóloga altamente eficiente. En tercer lugar, la levadura de panadero S. cerevisiae es uno de los pocos organismos para los que se desarrollan las manipulaciones con genomas mitocondriales. Por último, la levadura de panadero es un organismo facultativo aerobe-anaerobe, que permite el aislamiento y estudio de mutantes respiratorios defectuosos, ya que pueden crecer en medios que contienen fuentes de carbono fermentables.

Describimos el método para estudiar la expresión génica mitocondrial de la levadura de panadero S. cerevisiae en el nivel traslacional^4. Su principio principal proviene de varias observaciones. En primer lugar, el genoma mitocondrial de levadura codifica sólo ocho proteínas: tres subunidades del citocromo c oxidasa (Cox1p, Cox2p y Cox3p), tres subunidades de la sintasa ATP (Atp6p, Atp8p y Atp9p), una subunidad de la enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductasa, citocromo b (Cytb) y la proteína ribosomal mitocondrial Var1p^5. Este número es pequeño, y todos ellos pueden ser separados por electroforesis en un solo gel en las condiciones adecuadas. En segundo lugar, los ribosomas mitocondriales pertenecen a la clase procariota en lugar de eucariota^6,y por lo tanto, la sensibilidad a los antibióticos es diferente para los ribosomas citoplasmáticos y mitocondriales de levadura. Permite la inhibición de la traducción citoplasmática con cicloheximida, proporcionando las condiciones cuando el aminoácido etiquetado⁽³⁵S-metionina) se incorpora sólo en productos de traducción mitocondrial. Como resultado, el experimento proporciona información sobre la tasa de incorporación de aminoácidos en proteínas mitocondriales sintetizadas de novo, reflejando la eficiencia general de la traducción mitocondrial para cada uno de los ocho productos