Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

I mitocondri sono gli organelli profondamente coinvolti nel metabolismo di una cellula eucariotica. La loro catena di trasferimento di elettroni fornisce alla cellula ATP, la principale valuta energetica utilizzata in più vie biochimiche. Inoltre, sono coinvolti in apoptosi, sintesi di acidi grassi ed eme e altri processi. La disfunzione dei mitocondri è una fonte ben nota di malattia umana¹. Può derivare da mutazioni nei geni nucleari o mitocondriali che codificano componenti strutturali o regolatori degli organelli². Il lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae è un eccellente organismo modello per lo studio dell’espressione genica mitocondriale per diversi motivi. In primo luogo, il loro genoma^{è completamente sequenziato 3}, ben annotato, e una grande somma di dati è già disponibile in letteratura grazie alla lunga storia di indagini condotte con questo organismo. In secondo luogo, le manipolazioni con il loro genoma nucleare sono relativamente veloci e facili a causa del loro rapido tasso di crescita e del sistema di ricombinazione omologo altamente efficiente. In terzo luogo, il lievito di fornaio S. cerevisiae è uno dei pochi organismi per i quali vengono sviluppate le manipolazioni con genomi mitocondriali. Infine, il lievito di fornaio è un organismo facultativo aerobe-anaerobe, che consente l’isolamento e lo studio di mutanti respiratori difettosi, poiché possono crescere in mezzi contenenti fonti di carbonio fermentabili.

Descriviamo il metodo per studiare l’espressione genica mitocondriale del lievito di fornaio S. cerevisiae al livello trascizionale⁴. Il suo principio principale deriva da diverse osservazioni. In primo luogo, il genoma mitocondriale del lievito codifica solo otto proteine: tre subunità del citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell’ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell’enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p⁵. Questo numero è piccolo e tutti possono essere separati per elettroforesi su un singolo gel nelle condizioni appropriate. In secondo luogo, i ribosomi mitocondriali appartengono alla classe procariotica piuttosto che eucariotica 6 e,^quindi,la sensibilità agli antibiotici è diversa per i ribosomi citoplasmatici e mitocondriali del lievito. Permette l’inibizione della traduzione citoplasmatica con cicloeximide, fornendo le condizioni quando l’amminoacido etichettato⁽³⁵S-metonina) è incorporato solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Di conseguenza, l’esperimento fornisce informazioni sul tasso di incorporazione di amminoacidi nelle proteine mitocondriali sintetizzata de novo, riflettendo l’efficienza complessiva della traduzione mitocondriale per ciascuno degli otto prodotti