Étiquetage et visualisation des produits d'expression du génome mitochondrial dans Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae
Summary
Le génome mitochondrial de levure de Baker code huit polypeptides. Le but du protocole actuel est de les étiqueter tous et de les visualiser par la suite comme des bandes distinctes.
Abstract
Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Ils contiennent un génome circulaire et un appareil d’expression génique. Un génome mitochondrial de levure de boulanger code huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l’enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p. Le but de la méthode décrite ici est d’étiqueter spécifiquement ces protéines avec de la méthionine 35S, de les séparer par électrophoresis et de visualiser les signaux comme des bandes discrètes à l’écran. La procédure comporte plusieurs étapes. Tout d’abord, les cellules de levure sont cultivés dans un milieu contenant de la galactose jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade de croissance logarithmique tardive. Ensuite, le traitement cycloheximide bloque la traduction cytoplasmique et ne permet l’incorporation de 35S de méthionine que dans les produits de traduction mitochondrique. Ensuite, toutes les protéines sont extraites des cellules de levure et séparées par électrophoresis gel polyacrylamide. Enfin, le gel est séché et incubé avec l’écran de phosphore de stockage. L’écran est scanné sur un phosphorimager révélant les bandes. La méthode peut être appliquée pour comparer le taux de biosynthèse d’un seul polypeptide dans les mitochondries d’une souche de levure mutante par rapport au type sauvage, ce qui est utile pour étudier les défauts d’expression des gènes mitochondriaux. Ce protocole donne des informations précieuses sur le taux de traduction de tous les ARNm mitochondriaux de levure. Toutefois, il faut plusieurs contrôles et des expériences supplémentaires pour tirer des conclusions appropriées.
Introduction
Les mitochondries sont les organites profondément impliqués dans le métabolisme d’une cellule eucaryotique. Leur chaîne de transfert d’électrons fournit à la cellule de l’ATP, la principale monnaie énergétique utilisée dans de multiples voies biochimiques. En outre, ils sont impliqués dans l’apoptose, l’acide gras et la synthèse de l’hème, et d’autres processus. Le dysfonctionnement des mitochondries est une source bien connue de maladie humaine1. Il peut résulter de mutations dans des gènes nucléaires ou mitochondriques codant des composants structurels ou réglementaires des organites2. La levure saccharomyces cerevisiae de Baker est un excellent organisme modèle pour étudier l’expression des gènes mitochondriaux pour plusieurs raisons. Tout d’abord, leur génome estcomplètement séquencé 3, bien annoté, et une grande somme de données est déjà disponible dans la littérature grâce à la longue histoire des enquêtes menées avec cet organisme. Deuxièmement, les manipulations avec leur génome nucléaire sont relativement rapides et faciles en raison de leur taux de croissance rapide et de leur système de recombinaison homologue très efficace. Troisièmement, la levure de boulanger S. cerevisiae est l’un des rares organismes pour lesquels les manipulations avec des génomes mitochondriaux sont développées. Enfin, la levure de boulanger est un organisme de faculté d’aérobe-anaérobie, qui permet l’isolement et l’étude des mutants respiratoires défectueux, car ils peuvent se développer dans des médias contenant des sources de carbone fermentescibles.
Nous décrivons la méthode pour étudier l’expression mitochondrique de gène de la levure de boulanger S. cerevisiae au niveau translationnel4. Son principe principal provient de plusieurs observations. Tout d’abord, le génome mitochondrial de levure ne code que huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l’enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p5. Ce nombre est faible, et tous peuvent être séparés par électrophoresis sur un seul gel dans les conditions appropriées. Deuxièmement, les ribosomes mitochondriques appartiennent à la classe procaryotique plutôt qu’à l’eucaryotique6, et donc, la sensibilité aux antibiotiques est différente pour les ribosomes cytoplasmiques et mitochondriques de levure. Il permet l’inhibition de la traduction cytoplasmique avec le cycloheximide, fournissant les conditions où l’acide aminé étiqueté(35S-méthionine) est incorporé seulement dans les produits de traduction mitochondrial. En conséquence, l’expérience donne des informations sur le taux d’incorporation d’acides aminés dans les protéines mitochondriales synthétisées de novo, reflétant l’efficacité globale de la traduction mitochondriale pour chacun des huit produits
Protocol
Representative Results
Discussion
Les études de l’expression des gènes occupent une place centrale dans les sciences de la vie modernes. De nombreuses méthodes donnant un aperçu de ce processus complexe ont été développées. Ici, nous avons décrit la méthode permettant d’accéder à la biosynthèse protéique dans la levure de boulanger S. cerevisiae mitochondries. Il est généralement appliqué pour comparer l’efficacité de traduction des ARNH dans les mitochondries de souche de levure mutante par rapport au type sauvage pour accéde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par la Fondation russe pour la recherche fondamentale, subvention numéro 18-29-07002. P.K. a été soutenu par l’Affectation d’État du Ministère des sciences et de l’enseignement supérieur de la Fédération de Russie, numéro de subvention AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. a été soutenu par le Ministère des sciences et de l’enseignement supérieur de la Fédération de Russie, subvention numéro 075-15-2019-1659 (Programme de Kurchatov Center of Genome Research). Les travaux ont été réalisés en partie sur l’équipement acheté dans le cadre du Programme de développement de l’Université d’État de Moscou. I.C., S.L., et M.V.B. ont été en outre soutenus par la subvention de l’Université d’État de Moscou « Leading Scientific School Noah’s Ark ».
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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