Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondriën zijn de organellen die nauw betrokken zijn bij het metabolisme van een eukaryotische cel. Hun elektronenoverdrachtsketen voorziet de cel van ATP, de belangrijkste energetische valuta die wordt gebruikt in meerdere biochemische paden. Bovendien zijn ze betrokken bij apoptose, vetzuur- en heemsynthese en andere processen. Disfunctie van mitochondriën is een bekende bron van menselijke ziekte¹. Het kan het gevolg zijn van mutaties in nucleaire of mitochondriale genen die coderen voor structurele of regulerende componenten van organellen². Baker’s gist Saccharomyces cerevisiae is om verschillende redenen een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van mitochondriale genexpressie. Ten eerste is hun genoom volledig^{gesequentieerd 3}, goed geannoteerd, en een grote som gegevens is al beschikbaar in de literatuur dankzij de lange geschiedenis van onderzoeken uitgevoerd met dit organisme. Ten tweede zijn de manipulaties met hun nucleaire genoom relatief snel en gemakkelijk vanwege hun snelle groeisnelheid en zeer efficiënt homologe recombinatiesysteem. Ten derde is bakkersgist S. cerevisiae een van de weinige organismen waarvoor de manipulaties met mitochondriale genomen zijn ontwikkeld. Ten slotte is bakkersgist een aerobe-anaerobe facultatief organisme, dat isolatie en studie van respiratoire defecte mutanten mogelijk maakt, omdat ze kunnen groeien in media die fermenteerbare koolstofbronnen bevatten.

We beschrijven de methode om mitochondriale genexpressie van bakkersgist S. cerevisiae op translationeel niveau 4 te^bestuderen. Het belangrijkste principe komt uit verschillende observaties. Ten eerste codeert het gist mitochondriale genoom slechts acht eiwitten: drie subeenheden van de cytochroom c oxidase (Cox1p, Cox2p, en Cox3p), drie subeenheden van de ATP-synthase (Atp6p, Atp8p en Atp9p), een subeenheid van het ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase-enzym, cytochroom b (Cytb) en mitochondriaal ribosomaal eiwit Var1p⁵. Dit aantal is klein en ze kunnen allemaal worden gescheiden door elektroforese op een enkele gel in de juiste omstandigheden. Ten tweede behoren mitochondriale ribosomen tot de prokaryotische klasse in plaats van eukaryotisch⁶, en daarom is de gevoeligheid voor antibiotica anders voor gistcytoplasmatische en mitochondriale ribosomen. Het maakt de remming van cytoplasmatische vertaling met cycloheximide mogelijk, op voorwaarde dat de omstandigheden waarin het gelabelde aminozuur (³⁵S-methionine) alleen in mitochondriale vertaalproducten is opgenomen. Als gevolg hiervan geeft het experiment informatie over de snelheid van aminozuurincorporatie in mitochondriale eiwitten gesynthetiseerd de novo, wat de algehele efficiëntie van mitochondriale vertaling voor elk van de acht producten weerspiegelt