وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae
Summary
جينوم الخباز للخميرة الميتوكوندريا يرمز ثمانية من البوليبتيدات. الهدف من البروتوكول الحالي هو تسمية كل منهم وتصورها بعد ذلك كشرائط منفصلة.
Abstract
الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية من الخلايا eukaryotic قادرة على التنفس الهوائية. أنها تحتوي على الجينوم الدائري وأجهزة التعبير الجيني. جينوم الميتوكوندريا من خميرة الخباز يرمز ثمانية بروتينات: ثلاث وحدات فرعية من السيتوكروم سي أوكسيداز (Cox1p، Cox2p، و Cox3p)، ثلاث وحدات فرعية من سينثاز ATP (Atp6p، Atp8p، و Atp9p)، وهي وحدة فرعية من ubiquinol-cytochrome ج إنزيم oxidoreductase، السيتوكروم ب (سيتوب)، والبروتين الريبوزوم الميتوكوندريا Var1p. الغرض من الطريقة المذكورة هنا هو تسمية هذه البروتينات على وجه التحديد مع 35S methionine، وفصلها عن طريق الكهرباء وتصور الإشارات كشرائط منفصلة على الشاشة. يتضمن الإجراء عدة خطوات. أولاً، يتم استزراع خلايا الخميرة في وسط يحتوي على الغالاكتوز حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتأخرة. بعد ذلك ، يمنع علاج cycloheximide الترجمة السيتوبلاسميك ويسمح بإدراج 35S methionine فقط في منتجات الترجمة الميتوكوندريا. ثم يتم استخراج جميع البروتينات من خلايا الخميرة وفصلها بواسطة مادة الجل البولي أكرريلاميد الكهربائي. وأخيرا، يتم تجفيف هلام ومحتضنة مع شاشة الفوسفور التخزين. يتم مسح الشاشة على صورة فوسفورية تكشف عن العصابات. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لمقارنة معدل التركيب الحيوي لبوليبتيد واحد في الميتوكوندريا من سلالة الخميرة متحولة مقابل نوع البرية، وهو أمر مفيد لدراسة عيوب التعبير الجيني الميتوكوندريا. هذا البروتوكول يعطي معلومات قيمة حول معدل الترجمة لجميع mRNAs mRNS mitochondrial الخميرة. ومع ذلك، فإنه يتطلب العديد من الضوابط والتجارب الإضافية لجعل الاستنتاجات السليمة.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات المشاركة بعمق في عملية التمثيل الغذائي لخلايا النوى. وتزود سلسلة نقل الإلكترونات الخلية باستخدام ATP، وهي العملة النشطة الرئيسية المستخدمة في مسارات كيميائية حيوية متعددة. الى جانب ذلك ، فهي تشارك في موت الخلايا المبرمج ، والأحماض الدهنية والتوليف الهيم ، وغيرها من العمليات. الخلل في الميتوكوندريا هو مصدر معروف للمرض البشري1. يمكن أن تنتج عن الطفرات في الجينات النووية أو الميتوكوندريا ترميز المكونات الهيكلية أو التنظيمية من العضيات2. خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae هو كائن حي نموذجي ممتاز لدراسة التعبير الجيني الميتوكوندريا لأسباب عدة. أولاً، يتم تسلسل الجينوم الخاص بهم بالكامل3، مشروح بشكل جيد ، وهناك مجموعة كبيرة من البيانات متوفرة بالفعل في الأدب بفضل التاريخ الطويل من التحقيقات التي أجريت مع هذا الكائن الحي. ثانياً، التلاعب بجينومهم النووي سريع نسبياً وسهل بسبب معدل نموها السريع ونظام إعادة التركيب المتماثل عالي الكفاءة. ثالثاً، خميرة بيكر S. cerevisiae هي واحدة من الكائنات الحية القليلة التي يتم تطوير التلاعب مع الجينوم الميتوكوندريا. وأخيرا ، خميرة بيكر هو كائن حي أيروب anaerobe الكليات ، والذي يسمح العزلة ودراسة المسوخ المعيبة في الجهاز التنفسي ، لأنها يمكن أن تنمو في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصادر الكربون القابلة للتخمير.
ونحن وصف طريقة لدراسة التعبير الجيني الميتوكوندريا من خميرة بيكر S. cerevisiae في المستوى الترجمي4. ويأتي مبدأها الرئيسي من عدة ملاحظات. أولا ، فإن الجينوم الميتوكوندريا الخميرة ترميز ثمانية فقط من البروتينات : ثلاث وحدات فرعية من cytochrome c oxidase (Cox1p ، Cox2p، و Cox3p)، ثلاث وحدات فرعية من سينثاز ATP (Atp6p، Atp8p، و Atp9p)، وهي وحدة فرعية من ubiquinol-cytochrome ج oxidoreductase انزيم، السيتوكروم ب (سيتوب)، والبروتين الريبوسومي الميتوكوندريا Var1p5. هذا العدد صغير، ويمكن فصل كل منهم بواسطة الكهرباء على هلام واحد في الظروف المناسبة. ثانيا، ينتمي الريبوسومات الميتوكوندريا إلى الطبقة prokaryotic بدلا من6eukaryotic ، وبالتالي ، فإن حساسية للمضادات الحيوية تختلف عن الريبوسومات السيتوبلازمية والخميرة الميتوكوندريا. فهو يسمح بتثبيط الترجمة السيتوبلاسميكية مع السيكلوهيكسيميIDE، وتوفير الظروف عندما يتم دمج الأحماض الأمينية المسماة(35S-methionine) فقط في منتجات الترجمة الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، تعطي التجربة معلومات حول معدل دمج الأحماض الأمينية في بروتينات الميتوكوندريا التي تم تصنيعها في دي نوفو، مما يعكس الكفاءة الكلية لترجمة الميتوكوندريا لكل منتج من المنتجات الثمانية
Protocol
Representative Results
Discussion
تحتل تحقيقات التعبير الجيني جزءاً مركزياً في علوم الحياة الحديثة. وقد تم تطوير العديد من الأساليب التي توفر رؤى في هذه العملية المعقدة. هنا، وصفنا الطريقة التي تسمح للوصول إلى البروتين في التركيب الحيوي خميرة بيكر S. cerevisiae الميتوكوندريا. وعادة ما يتم تطبيقه لمقارنة كفاءة الترجمة من mRN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الروسية للبحوث الأساسية، منحة رقم 18-29-07002. وكان دعم P.K. من قبل الدولة تكليف وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم AAAA-A16-116021660073-5. تم دعم M.V.P. من قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم 075-15-2019-1659 (برنامج مركز كورشاتوف لبحوث الجينوم). وقد تم العمل جزئيا على المعدات التي تم شراؤها في إطار برنامج جامعة موسكو الحكومية للتنمية. I.C، S.L. و M.V.B بالإضافة إلى ذلك تم دعمها من قبل جامعة موسكو الحكومية منحة “المدرسة العلمية الرائدة سفينة نوح”.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-563 (1996).
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
