JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Fibroblastlardan Nöronal Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşüm ve Astrositlere Farklılaşma Kullanarak Nörolojik Hastalıklar için İn vitro Modelleme

Published: June 10, 2021
doi:
10.3791/62016
, , , , , ,
1Center for Gene Therapy,The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2College of Medicine, The Ohio State University

Summary

İnsan derisinden türetilmiş fibroblastları indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücrelere (iNPC’ ler) yeniden programlamak için bir protokol ve daha sonra indüklenmiş Astrositlere (iAs) farklılaşmalarını açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük miktarlarda iNPC’lerin ve iA’ların hızlı ve tekrarlanabilir üretimine yol açar.

Abstract

Nörolojik bozukluklar üzerine yapılan araştırmalar öncelikle nöronların hastalık mekanizmaları üzerindeki etkisine odaklanmaktadır. Hayvan modellerinin sınırlı mevcudiyeti, hücre tipinin hastalığa özel katkılarının incelenmesini ciddi şekilde etkiler. Üstelik hayvan modelleri genellikle insan hastalarında görülen mutasyon ve hastalık derslerinde değişkenliği yansıtmamaktadır. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC) üretimi için yeniden programlama yöntemleri hastaya özgü araştırmalarda devrim yaratmış ve hastalık mekanizmalarını incelemek için değerli araçlar yaratmıştır. Bununla birlikte, iPSC teknolojisinin zaman, işgücü taahhüdü, klonal seçicilik ve epigenetik belirteçlerin kaybı gibi dezavantajları vardır. Bu yöntemlerin son değişiklikleri, klonal izolasyonu veya pluripotent kök hücre durumunu atlayarak daha doğrudan hücre soylarının veya belirli hücre türlerinin üretilmesine izin verir. Nöronal Progenitör Hücreleri (iNPC’ler) cilt fibroblastlarından, nöralize edici ortamla birlikte retroviral vektörleri kullanarak üretmek için hızlı bir doğrudan dönüştürme yöntemi geliştirdik. iNPC’ler nöronlara (iNs) oligodendrositlere (iOs) ve astrositlere (iA’lar) ayırt edilebilir. iNPC’lerden farklılaşma sadece 5 gün sürdüğünden iAs üretimi hızlı ilaç ve hastalık mekanizması testini kolaylaştırır. Ayrıca, iA’larla çalışmak kolaydır ve saf popülasyonlarda çok sayıda oluşturulur. Çok sayıda nörolojik ve nörodejeneratif bozukluk için potansiyel terapötik stratejileri değerlendirmek için fare GFP+ nöronları ve hasta türevli iA’lar kullanarak son derece tekrarlanabilir bir ortak kültür tahlilleri geliştirdik. Daha da önemlisi, iA tahlilleri, tek bir plakada birden fazla küçük molekülün değerlendirilmesini kolaylaştıran 384 kuyu formatına ölçeklenebilir. Bu yaklaşım, çeşitli genetik geçmişe sahip birden fazla hasta hücre hattının eşzamanlı terapötik değerlendirilmesine izin verir. IA’ların kolay üretimi ve depolanabilirliği ve bir testte birden fazla bileşiği tarama kapasitesi, bu metodolojiyi kişiselleştirilmiş tıp için uyarlanabilir hale getirir.

Introduction

Alttaki hastalık mekanizmalarını anlamak, potansiyel terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olduğu için nörolojik hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Hayvan modelleri tarihsel olarak sinir sistemi hastalıklarını araştırmak için altın standart olsa da, potansiyel tedavilerin klinik bir ortama doğrudan çevrilmeleri genellikle sınırlı başarı gösterir1,2,3. Çeviri eksikliğinin nedenleri, farelerde genetik arka plan ve mutasyonların değişkenliğinin olmaması, hastalık fenotiplerinin eksik görüntülenmesi ve insan hastalarında insan hastalarında inbred fare suşlarında iyi resmedilmeyen ilaç duyarlılığı veya dozlamadaki değişimdir. Ayrıca, birçok nadir nörolojik bozukluk için, hiçbir veya az sayıda hayvan modeli mevcut yoktur. Hastalık mekanizmalarının doğrudan ilgili insan hücre tiplerinde incelenmesi, araştırmayı kolaylaştırabilir ve kliniğe çeviriyi iyileştirebilir. CNS hastalıkları için, biyopsiler invaziv olduğu veya hastalığın son aşamasında sadece ölüm sonrası alınabildiği için birincil insan hücrelerinin alınması zordur ve çok sınırlı bir kaynağı temsil eder. Son 15 yılda, hücresel yeniden programlama teknolojisinin gelişimi, insan nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkları in vitro olarak modelleme yeteneğini hızla genişlettir.

Hücre yeniden programlamanın geleneksel yöntemleri, fibroblastların veya diğer hücre türlerinin, üç mikrop katmanından da hücre tiplerine farklılaşabilen indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC’ ler) yeniden programlanmasını içerir4. Takahashi ve Yamanaka, dört kök hücre transkripsiyon faktörünün yeniden ifade edilebilmesinin somatik hücreleriiPSC’lereyönlendirmek için yeterli olduğunu gösteren ilk kişilerdi 5 . iPSC’ler daha sonra belirli hücre türlerine daha da farklılaştırılabilir. Ancak bu sürecin dezavantajı, stabil kök hücre klonları üretmenin ve izole etmenin emek yoğun ve zaman alıcı olmasıdır. Kök hücre klonunda somatik mutasyonlar veya anne hücresinin spesifik sapmaları da korunur ve çalışmanın sonuçlarını etkileyebilir6. Ek olarak, artan kanıtlar, kök hücrelere yeniden programlama işleminin hücresel hastalık mekanizmalarını etkileyebilecek değerli epigenetik değişiklikleri sildiğini göstermektedir4,7,8. Son yıllarda araştırmacılar, pluripotent kök hücre durumu 9 ,10 , 11,12’yiatlarken farklı hücre türlerinin daha doğrudan üretilmesine izin vermek için değiştirilmiş yeniden programlama yöntemlerine odaklandılar (13 ,14’teincelendi). İlk atılımlar, fibroblastların kardiyomiyositler 15 , nöronlar16ve hepatositler17’ye birden fazla soyuna özgü transkripsiyon faktörünün ektopik ekspresyonu veya mikroRNA’lar18 ile in vitro kombinatoryal yeniden programlanması ortaya koydu. Bunu, hücreleri nörolojik bozuklukları modellemek için doğrudan yeniden programlama çalışmaları izledi19,20. Yukarıda belirtildiği gibi, bu tür doğrudan yeniden programlama veya dönüştürme protokolleri, hız ve klonal izolasyon adımının ablasyonu da dahil olmak üzere klasik iPSC protokollerine göre potansiyel avantajlara sahiptir. Ayrıca, kanıtlar bu protokollerin hastanın yaşıyla ilgili daha fazla miktarda epigenetik bilginin korunmasına izin verdiğini ve muhtemelen aynı şeyin hastalıkla ilgili belirteçler için de geçerli olduğunu göstermektedir7,8.

Bugüne kadar nörolojik bozukluklarla ilgili in vitro araştırmaların çoğu öncelikle nöronlara odaklanmıştır. Bununla birlikte, astrositler gibi diğer hücre tiplerinin, mikroglia ve oligodendrositler, Alzheimer hastalığı (AD), Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), Parkinson hastalığı (PD), Huntington Hastalığı (HD), Multipl Skleroz (MS) gibi nörodejeneratif bozuklukların ve Rett sendromu (RTT), uyku bozuklukları, bağımlılık gibi diğer nörolojik patolojilerin ilerlemesinde ve hastalık patolojisinde kritik bir rol oynar. epilepsi, lizozomal depolama bozuklukları, depresyon, migren ve patolojik ağrı21,22,23,24,25,26. Astrositler merkezi sinir sistemindeki (CNS) en bol hücre tipidir ve yakın zamana kadar patolojik açıdan geniş ölçüde ihmal edilmiştir7. Artık sağlıklı CNS’nin neredeyse tüm homeostatik fonksiyonlarını desteklemede kritik bir role sahip oldukları bilinmektedir. Ek olarak, önemli bir patolojik etkiye sahip oldukları ve hastalık mekanizmasını anlamada ve terapötik stratejileri değerlendirmede çok değerli oldukları açıktır19.

Mevcut açıklamada, Yamanaka yeniden programlama faktörlerini (Klf4, Eki3/4, Sox2 ve c-Myc) ifade eden retroviral vektörler kullanarak insan hasta fibroblastlarının indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücrelere (iNPC’ ler) doğrudan dönüştürülmesi ve daha sonra nöralize edici ortama maruz kalması için bir protokol detaylandırıyoruz. Önceki çalışmalar, sinir hücrelerine doğrudan yeniden programlama için transkripsiyonel faktörlerin farklı kombinasyonlarını kullanmıştır (14’tegözden geçirilmiştir), ancak açıklanan protokolde kullanılan faktörler, viral vektörlerin ev üretiminde plazmidler olarak veya viral yeniden programlama kitlerine gitmeye hazır ticari olarak yaygın olarak mevcuttur. Ortaya çıkan iNPC’ler, nörolojik hastalıklardaki rollerini incelemek için indüklenmiş nöronlar (iNs)27, oligodendrositler (iOs)24 ve astrositler (iAS)19 olarak daha da ayırt edilebilir. Protokolümüz, mevcut protokollerin çoğunun insan astrositlerinin türetmesi için kullandığı zaman alıcı iPSC’lerin neslini içermez28. Doğrudan yeniden programlanmış iNPC’lerin yaklaşık% 98 ila% 100’ü, fibroblastlardan astrositlere doğrudan dönüştürme yöntemini kullanarak sadece% 2’ye kıyasla GFAP pozitif astrositler29’a farklılaşabilir. Son zamanlarda, tarif edilen yeniden programlama yöntemimizi kullanan karşılaştırmalı bir transkriptomik çalışma, donör fibroblastlardan yeniden programlanan iNPC’lerin, yaşla eşleştirilen ölüm sonrası astrositler ve primer astrositlere benzer transkripsiyonel ve fonksiyonel düzeyde yaşlanma özelliklerini koruyabileceğini göstermiştir29. Bu nedenle, bu dönüşüm protokolü, hastalık mekanizmalarını araştırmak ve yaşa bağlı nörodejeneratif ve nörolojik bozukluklar için yeni terapötik yaklaşımları değerlendirmek için güçlü bir araçtır.

Burada, iNPC’ler oluşturmak ve daha büyük ölçekli küçük moleküler tarama tahlilleri için en uygun olan iA’lara daha fazla farklılaşmak için kullanılan protokolü açıklıyoruz. Hastalık mekanizmaları ve iA’larla ilaç testi, nöronlarla ortak kültürler veya metabolik ve biyokimyasal analizler gibi farklı metodolojiler kullanılarak yapılabilir. Bu sistemin avantajı, iPSC’lere kıyasla bu hücre hatlarının bakım hızı ve kolaylığıdır. Ayrıca, iNPC’ler, uzun süreler boyunca sabit koşullar altında ilaç testini kolaylaştıran iAs farklılaşması için küçük porsiyonlarda dondurulabilir. Genel olarak, daha büyük örnek sayıların karşılaştırılması, daha büyük ve daha temsili bir hasta popülasyonunda bileşiklerin terapötik potansiyelini değerlendirmenin kapısını açan bu şekilde mümkün hale gelir.

Protocol

medya reaktif Karıştırılacak tutar Son konsantrasyon (%) Fibroblast medya DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX 500 mL 89 Fetal Sığır Serumu 50 mL 10 Antibiyotik-Antimykotik 5 mL 1 Temel ortam DMEM/F12 + Glutamax 500 mL 97 N-2 5 mL 1 B-27 5 mL 1 Antibiyotik-Antimykotik 5 mL 1 Dönüşüm ortamı Temel ortam 50 mL 99.9 FGF 1 μL 0,02 (20 ng/mL) EGF 1 μL 0,02 (20 ng/mL) Heparin 50 μL 0,1 (5 μg/mL) Nöral Progenitör Hücre (NPC) Ortamı DMEM/F12 + Glutamax 500 mL 96.9 N-2 5 mL 1 B-27 5 mL 1 Antibiyotik-Antimykotik 5 mL 1 FGF 10 uL 0.002 Astrosit Medya DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX 500 mL 89 Fetal Sığır Serumu 50 mL 10 Antibiyotik-Antimykotik 5 mL 1 N-2 1 mL 0.2 Tüm bileşenler karıştırıldıktan sonra ortam filtrelenmelidir. Dönüşüm ortamı (faktörlerle) her hafta taze olarak hazırlanmalıdır. Tablo 1. Protokolde yer alan tüm hücre türleri için ortam tarifleri. Tüm bileşenler büyük hacimler veya şırınna ve 0,2 um şırındıcı filtreler için steril vakum filtrasyon sistemi ile karıştırıldıktan sonra ortam filtrelenmelidir. Dönüşüm ortamı (faktörlerle) her hafta taze olarak hazırlanmalıdır. 1. Yetişkin insan fibroblastlarının nöronal progenitör hücrelere doğrudan dönüştürülmesi NOT: Bu protokolün şematik zaman çizelgesi Meyer (2014)19’da gözden geçirilebilir. Hücre bankalarından veya cilt biyopsilerinden elde edilebilen birincil insan derisi fibroblastlarını kullanın31. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 °C’de kültür hücreleri. Deneyde kullanılmadan önce çözülme sonrası en az 1-2 pasaj için pasaj hücreleri. Hücreler hazır olduğunda, oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca insan fibronektin (PBS’de seyreltilmiş 1:200) ile 6 kuyulu bir plakanın kuyusunu kaplayın. Hücreler kaplanmaya hazır olduğunda, fibronektin kabından çıkarın ve hemen hücre çözeltisi veya 2 mL fibroblast ortamı ekleyin (Tablo 1) – ortam eklemeden önce yemeğin kurumasına izin vermeyin. Hücrelerin ne kadar hızlı büyüdüğüne bağlı olarak, her biri 6 kuyulu bir insan fibronektin kaplı iki kuyuda 150.000 (hızlı büyüyen) – 200.000 (yavaş büyüyen) fibroblast.NOT: Viral transdüksiyonun transdüksiyondan sonra birkaç gün daha aynı tabakta tutabilmesi için hücreler yaklaşık% 70 birikmelidir. Dönüşüm için ertesi gün bir seçim yapmak için iki farklı yoğunlukta tohumlamak faydalı olabilir. Tohumlamadan sonraki gün, mikroskop altındaki fibroblastları kontrol edin ve hücre yoğunluğunu doğrulayın (-85 arasında) ve hatta optimum sonuçlar için kuyu boyunca tohumlama. Dört retroviral vektörle de (Eki3/4, Klf4, Sox2 ve c-Myc) bir kuyu çevirin – hızlı büyüme için 10 veya yavaş büyüyen fibroblastlar için 15 çokluk bir enfeksiyon (MOI) kullanın (transdüksiyon verimliliği her vektör için% 70 veya daha fazla pozitif hücreyi aşmalıdır). Kuyu başına toplam 1 mL hacme düzenli fibroblast orta ila viral karışım ekleyin ve % 5 CO2 doku kültürü inkübatöründe bir gecede 37 °C’de kuluçkaya yatırın. İkinci iyi tedavi edilmemiş bırakın ve doku kültürü inkübatörüne hücreleri döndürün.NOT: Retroviral vektörler bir satıcı tarafından satın alınabilir veya şirket içinde yapılabilir, protokoller çevrimiçi olarak kullanılabilir32. Transdüksiyondan sonraki gün, hücreleri PBS ile 1x yıkayın ve 1 mL taze fibroblast ortamı ekleyin. Ertesi gün, ortamı dönüştürme ortamına değiştirin. Artık fibroblast ortamından kurtulmak için hücreleri PBS ile 1x yıkayın ve ardından 1 mL dönüştürme ortamı ekleyin. Tedavi edilmeyen kuyunun medyasını da dönüştürme ortamı olarak değiştirin.NOT: Retroviral vektör tedavisi almayan fibroblastlar üzerindeki ortam değiştirilerek bile bazı morfolojik değişiklikler gözlenebilir, bu nedenle viral vektörlerin etkilerini belirlerken tedavi edilmemiş bir kuyuya (isteğe bağlı) sahip olmak yardımcı olacaktır. Hücreler dönüşüm ortamına geçtikten 2-4 gün sonra morfolojiyi değiştirmeye başlamalıdır. Mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve morfolojideki değişiklikleri izleyin (Şekil 1). Hücre ortamı, dönüştürme işlemi boyunca (1-2 mL dönüştürme ortamı, Tablo 1)ve sonraki iNPC kültürü için günlük olarak değiştirilmelidir. Hücrelerin ortamın kalan ‘unda kapalı kalmasını sağlarken ortamın ‘ini kuyudan dikkatlice çıkararak ortamı değiştirin.NOT: İçinde büyüme faktörleri olan medyanın hazırlık aşamasından sonraki 1 hafta içinde tüketilmesi gerekir. Hücreleri gözlemlemeye ve medyayı günlük olarak değiştirmeye devam edin (1-2 mL dönüştürme ortamı). Bazı hücre hatları, yapılar veya gevşek nöronal küreler gibi toplarda büyüyen gevşek yüksek yuvarlak oluşumlar oluşturmaya başlar(Ek Şekil 1 ve 19,33). Bu hücreleri ayırmamaya dikkat edin. Toplar ayrılırsa, 6 kuyulu bir plakanın iyi kaplanmış yeni bir fibronektin içinde toplanabilir ve yeniden kaplanabilir.NOT: Kendi başlarına genişletilirse, hücreler ilk plakaya göre daha az çeşitliliğe sahip olacaktır ve belirgin bir şekilde farklı bir hücre hattını temsil edebilir. Bu hücreleri bir sonraki bölme turunda dönüştürülen hücrelerin geri kalanıyla birleştirmenizi öneririz. Dönüşüm medyasında yaklaşık 5-6 gün sonra (zor hücre hatları için 12 güne kadar) veya hücreler çok yoğun hale geldiğinde, onları 1:2 veya maksimum 1:3’e geçirmek.NOT: Dönüştürme işlemi boyunca hücreleri yüksek yoğunlukta tutmak çok önemlidir. 2. Dönüştürme ve iNPC bölme prosedürü Hücre müfreze çözeltisini (örneğin, Accutase) ısıtın ve oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca fibronektin (PBS’de 1:200, 1 mL kaplama hacmi) ile uygun sayıda 6 kuyuyu kaplayın. Fibronektin kaplama olumsuz etki olmadan daha uzun olabilir, ancak kaplama süresini kısaltmamaya dikkat edilmelidir. Hücreleri herhangi bir hücreyi ayırmadan PBS ile dikkatlice yıkayın (PBS’yi hücrelere hafifçe uygulamak için kuyunun duvarını kullanın). PBS’yi pipetlerle veya aspirasyonla dikkatlice çıkarın. 0,5 mL hücre dekupment çözeltisi ekleyin ve bir doku kültürü inkübatörüne 37 °C’de 2-3 dk kuluçkaya yatırın. Çoğu hücrenin ayrıldığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin. Tüm hücreler çıktıysa, 2 mL taze dönüştürme ortamı ekleyin ve kümeleri ayrıştırmak için (gerekirse) 2-3 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Hücreleri 15 mL’lik bir tüpte toplayın ve hücre ayırma çözeltisini daha da seyreltmek için ek 3 mL ortam ekleyin. Tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için kuyuyu önce ekstra medya ile yıkayın. Oda sıcaklığında 200 x g’da 4 dakika santrifüj.NOT: Hücreleri veya iNPC’leri dönüştürmek, medyada hücre ayırma çözümünün varlığına karşı son derece hassastır. Artık enzimin santrifüjlenmesi ve süpernatantın çekilmesi ile çıkarılması kesinlikle gereklidir. Hücre peletinden süpernatant çıkarın ve hücreleri 1 mL taze ortamda yeniden biriktirin. Hücre kümelerini çözmek için 2-3 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet. Fibronektin kaplamalı 6-kuyulardan çıkarın ve hemen her kuyuya 1 mL taze ortam ekleyin (fibronektin kurumasına izin vermeyin). 1:2’lik bir bölünme oranı için, bir kuyuya 0,5 mL, ikinci bir kuyuya da 0,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Doku kültürü inkübatöründe 37 °C’de kültür hücreleri. Hücreleri, 6 kuyuyu kuzey-güney-doğu-batı yönünde (dairesel değil) hafifçe sallayarak dağıtın ve doku kültürü inkübatörüne koyun. Ertesi gün mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve ortamı değiştirin (1-2 mL). Hücreler yeniden bölünmeye hazır olana kadar her gün ortam değiştirin.NOT: Bu noktada hücre çoğalması hızlanmaya başlamalı ve hücreler 2-3 gün içinde ikinci bir bölünmeye hazır olmalıdır (çok yavaş büyüyen hatlar için 4 gün). Bu yeni bölmede, dönüşüm medyasındaki hücrelerin bir kuyusunun tohumunun, diğerinin ise EGF / heparin olmadan artan konsantrasyonda sadece FGF içeren NPC medyasında tohum (Tablo 1).NOT: Bazı hücre hatları yaklaşık 10 gün sonra dönüştürme medyasında durgun bir duruma ulaşır ve NPC ortamına geçmek hücre büyümesine yardımcı olabilir. Ek olarak, NPC’ler NPC medyasında yetiştirildiğinde daha spesifik, daha küçük bir şekle sahiptir19. Bu noktada, iNPC’ler farklılaşmaya ve daha fazla kullanıma hazırdır. iNPC’lerin medyasını (1-2 mL) günlük olarak değiştirmeye devam edin. 6 kuyunun iki veya üç birleştirilmiş kuyularını birleştirerek NPC’leri 10 cm’lik yemeklere genişletin. 10 cm’lik yemekler için ortam hacmi tipik olarak 12-15 mL’dir. Bir sonraki bölmede, bu hücreleri çok sayıda hücre stokunun nesilleri için üç veya dört adet 10 cm’lik yemeklere (12-15 mL ortam) daha da genişletin. 10 cm’lik yemekler genellikle çoğalma oranına bağlı olarak her 3-4 günde bir 1:3 veya 1:4’te bölünür. 3. NPC’lerden indüklenmiş astrositler oluşturma Taze iNPC’lerden astrosit yapmak için, tohum iNPC’leri (10 cm fibronektin kaplı plakalarda) doğrudan 10 mL astrosit ortamında (Tablo 1) ertesi gün yaklaşık% 10 izdiah olacak şekilde. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 °C’de kültür hücreleri.NOT: Önerilen tohumlama yoğunluğu genellikle 10 cm’lik bir NPC kabının hücre resüspensiyonunun 50 μL’dir, ancak bölünme oranlarına göre son bir hacme seyreltilirler (örneğin, 1:3 bölme için 3 mL, 1:4 bölme için 4 mL, vb.). Kaplamadan üç gün sonra iA’ların ortasını (10 mL astrosit ortam) değiştirin. Hücreleri 5-7 gün boyunca farklı tutun.NOT: iA’lar birden fazla pasajı iyi tolere etmez, bu nedenle NPC’leri her böldüğünüzde taze astrositler yapmak daha iyidir. Deneme için tohumlama için, 2.1-2.7 adımlarında açıklandığı gibi tripsin veya hücre ayırma çözümünü kullanarak astrositleri bölün. Önerilen tohumlama yoğunlukları Tablo 2’yedahildir. Plaka Türü Kuyu Başına Astrositler 384 kuyu 2500 96-kuyu 10000 24 kuyu 40000 6 kuyu 150000 Tablo 2. Plaka alanı başına önerilen iA tohumlama yoğunluğu. En yaygın doku kültürü plakalarında bir monolayer oluşturmak için tohumlanan tipik iA sayısı. 4. Donmuş NPC stoklarından astrosit farklılaşması için bölümlerin hazırlanması ve çözülmesi (3. adıma alternatif) NOT: Kültürde iNPC’leri korumaya alternatif olarak, astrositler doğrudan dondurulmuş bir stoktan da üretilebilir. Bunu yapmak için, iNPC’ler daha küçük bölümlerde dondurulur. Tablo 3, 10 mL Astrosit ortam içeren 10 cm’lik bir tabakta çözülecek kısımlar için donma ve çözülme hacimlerini göstermektedir. Porsiyon Boyutu Hücre Süspansiyonu (μL) Donma ortamı (μL) Toplam hacim (μL) Buzları Çözerek 4x 400 400 800 İki adet 10 cm’lik yemek 2x 200 200 400 Bir adet 10 cm’lik tabak Tablo 3. iA’lar oluşturmak için iNPC’nin nasıl bölümlerek oluşturulana ilişkin yönergeler. Bölümleri oluşturmak için iNPC süspansiyon ve dondurma ortamı oranı. Hücre süspansiyonu donma ortamıyla karıştırıldığında son DMSO konsantrasyonu olduğunu unutmayın. Dondurulmuş iNPC stoklarından astrosit yapmak için, sıvı azot depolama tankından porsiyon şişesini çıkarın ve 37 °C’de hızla çözün. Hücreler çözülür çözülmez, 5 mL astrosit ortam içeren 15 mL’lik bir tüpte pipet hücresi çözeltisi. 200 x g ve oda sıcaklığında 4 dakika santrifüj. Süpernatant çıkarın ve 1 mL taze astrosit ortamında yeniden diriltin. Fibronektin kaplı 10 cm’lik bir yemeğe 9 mL taze astrosit ortamı ekleyin ve 1 mL hücre çözeltisi ekleyin. Hücreleri kuzey-güney-doğu-batı hareketinde yavaşça dağıtıyor. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 °C’de kültür hücreleri.

Representative Results

Bu protokol, Yamanaka faktörlerini içeren retrovirüsleri kullanarak doğrudan insan derisi fibroblastlarından iNPC’lerin hızlı ve kolay üretilmesini sağlar. Bu yöntem, kök hücre durumunu ve klon seçimi ihtiyacını atlayarak klonal varyasyonu önlemeye izin verir. Hücreler dönüşüm sürecinden geçerken akılda tutulması gereken önemli adımlar fibroblast tohumlama yoğunluğu, ortam pH’ı ve hücrelerin optimum bir konfluenste tutulmasıdır. Dönüştürme işlemi sırasında en uygun bölme konfilüsyolojisi ve morfoloji değişikliklerine örnekler Şekil 1’de bulunabilir. Şekil 1. Yamanaka faktörlerinin retroviral karışımını ekledikten sonra dönüştürme işleminin temsili görüntüleri. Fibroblastlar yirmi dört saat sonra Yamanaka faktörleri ile tohumlandı ve transdüklendi. virüs sonrası iki gün (DPV), ortam dönüştürme ortamı olarak değiştirildi. Hücreler geçişe hazır olana kadar dönüşüm ortamlarında kültürlendi (13 DPV). Hücreler ertesi gün izdihama (14 DPV) ulaşmak için post pasaj tohumlandı. Sonraki pasajlar, nöronal progenitör hücreler hızla bölünmeye başlayana kadar bu yoğunluğu korudu. Ölçek çubuğu 200 μm’dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Dönüştürme işlemi tamamlandıktan sonra, NPC’ler fibroblast belirteçlerinin ve morfolojisinin güçlü bir şekilde azaltılmış ifadesini veya ifadesini göstermez ve NPC’ye özgü hücre işaretlerini ifade edecektir (Şekil 2). Ayrıca, iNs, iOs ve iAs gibi farklı hücre hatları oluşturmak için de kullanılabilirler. Şekil 2. Dönüştürme işleminden geçen hücreler hücreye özgü işaretleyicileri ifade edin. Hasta fibroblastları (A), indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücreler (iNPC’ler (B) ve indüklenmiş Astrositler (iAs (C) hücreleri 24 kuyu doku kültürü tedavi edilen bir plakada cam kapaklar üzerinde tohumlandı. Hücreler için immünostained: fibroblast spesifik hücre belirteçleri (A), Vimentin (yeşil) ve TE7 (kırmızı), iNPC spesifik hücre işaretleyici (B), Nestin (kırmızı) ve iAs hücre işaretleyici (C) GFAP (mor) ve iNPC işaretleyici Nestin (yeşil). Ölçek çubuğu 50 μm’dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Deneyimlerimize göre, özellikle iA’lar, saf popülasyonlarda ( veya daha fazla GFAP pozitif hücre29)tekrarlanabilir büyük sayılarda üretilebildiğinden ilaç ve hastalık mekanizması testi için çok değerlidir. iA’lar, bölme sırasında küçük bir hücre aliquot’u veya daha önce dondurulmuş bir iNPC bölümü alınarak ve doğrudan astrosit ortama kapatılarak iNPC’lerden ayrılabilir. Bu işlem sırasında önemli hususlar, iNPC’lerin ilk tohumlama yoğunluğunu düşük tutmaktır (Şekil 3 ve Şekil 4), çünkü yüksek yoğunluğun farklılaşma sürecini engellediği gösterilmiştir (Şekil 4) ve asitleşme sağlıklı astrositleri bile aktive edebileceği için medya pH’ına ek dikkat gösterilmiştir. Şekil 3. iNPC’lerden iAs oluşturma işleminin temsili görüntüleri. iNPC’ler Astrosit ortamlarında (Tablo 1) düşük tohumlama yoğunluğunda tohumlanır. İyi bir tohumlama yoğunluğu, tohumlama sonrası ilk gün (DPS) (solda) yaklaşık% 10’dur; ancak bu yoğunluk hücrelerin büyüme hızına göre ayarlanabilir. Tipik iAs morfolojisi 5 DPS’den (ortada) sonra gözlenebilir. Bazı durumlarda, uzun, dikenli uzantılarla anormal astrosit morfolojisi gözlenebilir. Bu değişiklik astrosit aktivasyonunun göstergesidir ve hastalık durumuna veya yanlış kültleme tekniklerine ikincil olabilir (sağda). Ölçek çubuğu 200 μm’dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4. iNPC tohumlama yoğunluğu iAs farklılaşma verimliliğini etkiler. Kontrol iNPC hatları, tohumlama yoğunluğunun farklılaşma üzerindeki etkilerini göstermek için Astrosit ortamlarında düşük (A) ve yüksek (B) yoğunlukta tohumlanmıştır. 5 DPS, düşük yoğunluklu çizgi astrositlere özgü belirteçleri ifade ederken, yüksek yoğunluklu çizgi iNPC benzeri bir morfoloji ile iNPC ve iAs işaretleyicilerinin bir karışımını gösterir. Ölçek çubuğu 50 μm’dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 1. Yamanaka faktörlerinin retroviral karışımını ekledikten sonra dönüşüm sürecinin ek rakamları. 12 DPV (geçişten 1 gün önce) ve 19 DPV (geçişten 6 gün sonra) dönüştürme işleminin görüntüleri. Geçişten önce ve sonra hücreler arasındaki morfoloji farkına dikkat edin, 12 DPV hücresinde top benzeri bir yapı morfolojisi vardır. Bir geçişten sonra ve dönüştürme medyasında birkaç gün (tablo 1) hücreler NPC benzeri bir morfoloji görüntülemeye başlar. Ölçek çubuğu 200 μm’dir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Özetle, doğrudan dönüşüm, hasta cilt fibroblastlarından indüklenmiş nöronal progenitör hücreler üretmek için hızlı ve kolay bir yöntemdir. Bu yöntem, hızı ve bakımı kolay üretilen çok sayıda hücre nedeniyle avantajlıdır. Dahası, artan kanıtlar, doğrudan yeniden programlama yöntemlerinin klasik iPSC yeniden programlama teknolojisine kıyasla daha az epigenetik izi ortadan kaldırdığını, bu nedenle hastalık ortamını daha sağlam bıraktığını göstermektedir4,7,8. INPC’lerin astrositlere farklılaşması çok düzdür ve birden fazla bağımsız laboratuvar arasında bile oldukça tekrarlanabilir19,29,33. iNPC’ler küçük porsiyonlarda dondurulabilir ve farklılaşma amacıyla doğrudan çözülebilir, bu da geçiş sayıları benzer tutulabildiğinden deneyler arasındaki varyasyonu azaltmaya yardımcı olur. Astrositler birçok nörolojik hastalıkta hastalığın ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar ve bu nedenle çalışmak için ilginç bir hücre tipidir. Astrositler mekanistik çalışmalar, metabolik çalışmalar veya ilaç testi tahlilleri için kullanılabilir ve genellikle monolayer olarak yetiştirilir. Ayrıca, astrositler, her ikisi de ilaç testi için iyi okumalar olan nöronal sağkalım ve morfoloji üzerindeki etkisini değerlendirmek için fare veya insan nöronları ile ortak kültür sistemlerinde birleştirilebilir34.

Bu protokolün başarıyla kullanılabilmesi için birkaç noktanın ve potansiyel sınırlamaların akılda tutulması gerekir. Örneğin insan derisi fibroblastları, viral vektörlere yanıt olarak hücre bölünme oranlarına göre büyük ölçüde değişir. Bunlar standart hücre hatları olmadığından, insanlığın kendisi kadar değişkendir, her çizgi farklıdır. Birçok yeniden programlama yöntemine gelince, orta ila hızlı hücre bölünme oranına sahip fibroblastları zar zor çoğalan hücrelere göre yeniden programlamak daha kolaydır. Replikasyon oranı, cilt biyopsisi kalitesinden ve işlenmesinden, fibroblastların geçiş sayısından ve elleçlemeden etkilenebilir. Birincil cilt fibroblastları ile çalışırken, senescence indüksiyonunu önlemek için hücrelerin çok yoğun olmasına izin vermemek önemlidir. Fibroblastlar iyi büyümezse, yeni bir stok veya daha düşük bir pasaj denemek en iyisidir, ancak bazı durumlarda hastalığın kendisi de bir rol oynayabilir. Hücre bölünmesi bazen fibroblast ortamlarında standart %10’a kıyasla %15 veya %20 FBS kullanılarak iyileştirilebilir.

Yeniden programlayan viral vektörlerin kalitesi başarı için büyük önem taşımaktadır. Elimizde retroviral vektörler lentiviral vektörlere veya entegre olmayan diğer virüslere kıyasla daha verimliydi; bununla birlikte, bu viral vektör kalitesine ve saflığına bağlı olabilir. Ticari retroviral vektör kitleri genellikle viral vektör konsantrasyonunu ve genellikle belirli bir hücre hattı için enfeksiyonun çokluğunu belirtir. Birincil fibroblastların viral vektör alımını belirlemek için şirketler tarafından kullanılan hücre hattından farklı olduğunu akılda tutmak önemlidir. Ayrıca, aynı ticari kiti sipariş ederken bile, partiler arasındaki değişim yaygındır. Ayrıca, viral vektörlerin alımı da fibroblast hücre çizgileri arasında değişir. Bazı çizgiler daha hassas olabilir ve bu nedenle transdüklenmiş hücreler ölebilirken, diğer hücre hatları viral alıma karşı daha dirençli olabilir. Bu nedenle, belirli bir hücre hattı için transdüksiyon verimliliğinin belirlenmesi, özellikle hücre çizgisi yavaş büyüyorsa veya önceki dönüştürme girişimleri başarısız olursa önemli olabilir. Elimizde, dönüşüm için belirli bir retroviral vektörün ne kadarının gerekli olduğunu değerlendirmenin en iyi yolu, viral vektörün birkaç seyreltme ile immünofluoresan boyama yapmaktır. Her vektör için transjeni ifade eden hücrelerin sayısı daha sonra% 70 veya daha yüksek bir transdüksiyon verimliliği amacıyla sayılabilir. Deneyimlerimize göre, çoğu hücre hattı için benzer MOI’ler kullanılabilir, ancak gerekirse MOI ayarlanabilir.

Dönüştürme işlemi sırasında, hücreleri çok erken bölmemek önemlidir. Hücrelerin bölünmeye hazır olduğu süre, birincil hücre çizgisi ve özellikleri, kullanılan viral vektörün kalitesi ve ortam kalitesi dahil olmak üzere birden fazla faktöre bağlıdır. Daha da önemlisi, hücreler yüksek yoğunlukta tutulduğunda dönüşümün başarı oranı çok daha yüksektir. Hücreler morfolojiyi değiştirmeye başlasa bile, hücreleri erken bölmektense ilk kuyuda daha uzun süre bırakmak daha iyidir. Bölünme çok erken gerçekleşirse, dönüştürme ilerlemesinde durabilir ve hücrelerin fibroblast benzeri şekil ve davranışa geri dönmesine neden olabilir. Ayrıca, çok erken seyreltmek, daha önce gözlenen NPC’lerin küçük ve kompakt hücre gövdelerine kıyasla daha uzun hücre gövdelerine neden olabilir. Bu nedenle, ilk bölünmeler her zaman muhafazakar olmalıdır; hücreleri çok fazla seyreltmeye kıyasla 1:1 veya 1:2 bölünmesiyle çok yoğun tutmak daha iyidir. İlk bölünmeden sonra bir miktar hücre ölümü bekleniyor. Not olarak, hücreler bölündükten sonraki ilk gün her zaman daha kötü (daha düz) görünür, bu normaldir. Hücre şekli hakkında en iyi kararlar 2-3 gün sonra verilmelidir. Daha da önemlisi, büyüme faktörlerinin ve medya bileşenlerinin kalitesi de çok önemlidir. Tamamen hazırlanmış medyanın en fazla 5-7 gün kullanılabilmesi için büyüme faktörleri içeren az miktarda medya hazırlamak önemlidir. Ortamı oda sıcaklığında veya 37°C’de uzun süre tutmayın. Hızlı kullanın ve ortam değişikliği yapılır yapılmaz soğutun. Ayrıca, ortam hacmini 2 mL yerine 1 mL’de düşük tutmak, özellikle dönüştürmeye daha dayanıklı hücre hatları için yardımcı olabilir. Hücreler ortamı hızla tüketirse, bu da kırmızı ortam renk formunda sarıya (asitleşme oranı) bir değişiklikle gözlemlenebilir, ortamın hacmini 2 mL’ye kadar ayarlayın. Hızlı medya tüketimi olumlu bir işarettir ve genellikle dönüşümün sonraki aşamalarında artan çoğalma ile birlikte gözlenir.

NPC’ler de medyadaki accutase varlığına karşı çok hassastır ve akutase inkübasyon süresini kısa tutmak çok önemlidir. 2-4 dakikalık bir kuluçka süresi öneriyoruz, hücreleri ne zaman ayrıldıklarını görmek için mikroskop altında sık sık kontrol edin. Enzim karışımını ortamdan çıkarmak için bölündükten sonra hücrelerin santrifüjlenimi esastır. İfade profillerinin değiştirilmesine yol açan genişletilmiş kültleme üzerine hücre çizgileri değişebileceğinden, geçiş numarasını akılda tutmak da önemlidir. Bu nedenle, birçok hücre stoklarını erken geçişlerde dondurmak önemlidir. Hücreler % 10 DMSO ve% 90 NPC ortamlarında dondurulmalı ve sıvı nitrojende uzun süre saklanmalıdır. Bu ortamdaki serum eksikliği nedeniyle, donma odaları kullanılarak yavaş bir donma sağlamak ve bir kez bir gecede dondurulduktan sonra derhal sıvı nitrojene aktarılması kritik öneme sahiptir. Bu protokolde klonal seleksiyon yapılmazken, genişletilmiş kültleme ve pas geçmenin, ilk hücre popülasyonunun olumlu büyüme ve sağkalım oranı ile doğal olarak seçilmesine yol açtığı mümkündür. Bu nedenle, deneyler yaparken geçiş numarasını ve işlemeyi akılda tutmak önemlidir. Deneyler için daha düşük pasajlar kullanmayı tercih ediyoruz, mümkünse hücre çizgilerini 20’den fazla kez geçmeyi aşmuyoruz. NPC’ler hızla büyüdüğünden, deneyler için daha düşük geçitlerde çok sayıda stok dondurulabilir. Özellikle yüksek büyüme oranlarına sahip hücre hatları, medya asitlenmesi riski daha yüksektir. Bu nedenle, hücre hatları farklı bir hızla büyüdükçe, ortam miktarının çoğalmaya göre ayarlanması gerekebilir. Hücreler sürekli olarak yüksek asitli ortamda bırakılırsa, hem kontrol hem de hastalık hücre hatlarının sağlığını etkileyebilir. Bu, sağlıklı astrositlerin bile reaktif hale gelmesine neden olur ve daha fazla farklılaşma ve deneylerde kullanımlarını etkiler.

Astrosit farklılaşması için, yüksek yoğunluk hücrelerin farklılaşmasını önleyeceğinden ve daha yüksek oranlarda çoğalmaya devam edeceklerinden, hücreleri düşük yoğunlukta tutmak önemlidir. Bu nedenle, tohumlama yoğunluğunun çoğalma oranlarına bağlı olarak her hücre hattı için ayarlanması gerekir. Uygun farklılaşmayı sağlamak için farklı tohumlama yoğunluklarını denemenizi ve astrosit işaretleyicilerle boyama/RT-PCR gerçekleştirmenizi öneririz. IAs kalitesi, nöronlarla ortak kültür tahlilleri kullanılarak sağlıklı kontrollerle birlikte değerlendirilebilir. Hastalık patolojisi reaktif bir fenotipe yol açmadığı için, nöronlar birkaç gün boyunca iA’larla temas halinde canlı kalmalıdır. Astrosit morfolojisi bireysel hücre hatları arasında büyük ölçüde değişebilir ve hastalık fenotipi tarafından da etkilenebilir. Ayrıca, astrositlerin yoğun olarak etkilendiği hastalıklarda, büyük, uzun uzantılı reaktif bir fenotip gösterebilirler.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Araştırma çalışmalarına kritik örnekler bağışlayan tüm hastalara ve sağlıklı gönüllülere teşekkür ederiz. Ayrıca, rochelle Rodrigo’ya doku kültüründe sürekli uzman teknik yardımı için ve Laura Ferraiuolo’ya laboratuvardaki tekniği bağımsız olarak onay verdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 NS644912-4 ve RC2 NS69476-01 (A.L.S.’ye) ve Packard Center for ALS Research Grant P2ALS ve Helping Link Foundation’dan fon aldı. K.M. ayrıca İsviçre Ulusal Bilim Vakfı’nın yanı sıra Kas Distrofisi Derneği, Rett Sendromu Araştırma Vakfı ve SCN2A vakıflarının Ailelerinden Genç Araştırmacı Geliştirme Ödülü’nden fon aldı.

Materials

100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic Corning 430167 Tissue culture
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene USA Scientific 1475-1611 Used for lifting and centrifuge cells
50mL Conical Centrifuge Tubes USA Scientific 1500-1811 Media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062 Antibiotic with antifungal activity for media preparation
B-27  Supplement (50X), serum free Invitrogen 17504044 For NPC and base media
Cryogenic vials  1.2ML Corning CLS430658-500EA For freezing cell stocks
DMEM, high glucose, GlutaMAX  Supplement, pyruvate Gibco 10569010 For fibroblast and Astrocyte media
DMEM/F-12, GlutaMAX  supplement Gibco 10565042 For NPC and base media
DMSO Sigma D2438-50ML For freezing cell stocks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190136 Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit ALSTEM RF101 Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house.
Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000-036 Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher 14-955-461 Filter media (50mL)
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3149-10KU Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X
Human Plasma Fibronectin Purified Protein Millipore Sigma FC010-10MG Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating.
Isopropanol (technical grade) Fisher Scientific S25372A For freezing cell stocks
Mr. Frosty Thermo Fisher 5100-0001 For freezing cell stocks
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048 For Astrocyte, NPC and base media
Recombinant Human EGF Preprotech AF-100-15 Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots
Recombinant Human FGF-basic Preprotech 100-18B Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs.
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System Millipore Sigma S2GPU05RE Media filtration
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid Fisher 08-772-1B Tissue culture
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Invitrogen 25300062 Lifting of Fibroblasts and Astrocytes
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile Millipore Sigma 80-2502 Filter media (50mL)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leenaars, C. H. C., et al. Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223 (2019).
  2. Rhrissorrakrai, K., et al. Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge. Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).
  3. Hartung, T. Thoughts on limitations of animal models. Parkinsonism & Related Disorders. 14, 81-83 (2008).
  4. Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).
  5. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  6. Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability. PLoS Genetics. 8 (8), 1002913 (2012).
  7. Stricker, S. H., Gotz, M. Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming. Neurobiology of Disease. 148, 105174 (2020).
  8. Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359 (2017).
  9. Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state. Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).
  10. Kim, E., Tae, G. Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate. Biomaterials Research. 20, 39 (2016).
  11. Kim, J., et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).
  12. Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).
  13. Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).
  14. Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. Direct lineage reprogramming to neural cells. Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  16. Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
  17. Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors. Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).
  18. Grath, A., Dai, G. Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Biological Engineering. 13, 14 (2019).
  19. Meyer, K., et al. Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).
  20. Lee, M., et al. Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson’s Disease Patients. International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).
  21. Meyer, K., Kaspar, B. K. Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish. Brain Research. 1656, 27-39 (2017).
  22. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42 (5), 1291-1301 (2014).
  23. Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
  24. Ferraiuolo, L., et al. Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).
  25. Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington’s Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258 (2019).
  26. Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).
  27. Hautbergue, G. M., et al. SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits. Nature Communications. 8, 16063 (2017).
  28. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).
  29. Gatto, N., et al. Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease. Aging Cell. , (2020).
  30. Caiazzo, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors. Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).
  31. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
  32. Pear, W. Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants. Current Protocols in Molecular Biology. , 11 (2001).
  33. Boczonadi, V., et al. Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons. Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).
  34. Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).

Tags

In Vitro ModelingNeurological DiseasesFibroblastsNeuronal Progenitor CellsAstrocytesDirect ConversionSkin BiopsyRetroviral VectorsOct3/4Klf4Sox2C-MycTransductionNeurodegenerative DiseasesCell CultureCo-culturesDisease MechanismsMedication Testing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dennys, C. N., Sierra-Delgado, J. A., Ray, S. S., Hartlaub, A. M., Roussel, F. S., Rodriguez, Y., Meyer, K. In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes. J. Vis. Exp. (172), e62016, doi:10.3791/62016 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image