Мы описываем протокол перепрограммирования фибробластов кожи человека в индуцированные нейронные клетки-предшественники (iNPCs) и их последующую дифференциацию в индуцированные астроциты (iAs). Этот метод приводит к быстрому и воспроизводимому поколению iNPCs и iAs в больших количествах.
Исследования неврологических расстройств сосредоточены в первую очередь на влиянии нейронов на механизмы заболевания. Ограниченная доступность моделей животных серьезно влияет на изучение специфических вкладов клеточного типа в болезни. Кроме того, модели животных обычно не отражают изменчивость мутаций и курсов заболеваний, которые можно увидеть у пациентов. Методы перепрограммирования для генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) произвели революцию в конкретных исследованиях пациентов и создали ценные инструменты для изучения механизмов заболевания. Тем не менее, технология iPSC имеет такие недостатки, как время, трудовые обязательства, клональная избирательность и потеря эпигенетических маркеров. Недавние модификации этих методов позволяют более прямое поколение клеточных линий или конкретных типов клеток, в обход клональной изоляции или плюрипотентного состояния стволовых клеток. Мы разработали метод быстрого прямого преобразования для генерации индуцированных нейронных клеток-предшественников (iNPCs) из фибробластов кожи с использованием ретровирусных векторов в сочетании с неврализирующими средствами массовой информации. INPCs можно продифференцировать в нейроны (iNs) oligodendrocytes (iOs) и астроциты (iAs). Производство iAs облегчает быстрое тестирование механизма лекарственных препаратов и болезней, так как дифференциация от INPCs занимает всего 5 дней. Кроме того, iAs легко работать и генерируются в чистом населения в больших количествах. Мы разработали высокоразвлечимый анализ совместной культуры с использованием нейронов мыши GFP и полученных пациентом iAs для оценки потенциальных терапевтических стратегий для многочисленных неврологических и нейродегенеративных расстройств. Важно отметить, что анализы iA масштабируемы до формата 384 хорошо, облегчая оценку нескольких малых молекул в одной пластине. Такой подход позволяет одновременно терапевтической оценки нескольких клеточных линий пациента с разнообразным генетическим фоном. Легкое производство и хранение iAs и емкость для проверки нескольких соединений в одном анализе делает эту методологию адаптируемой для персонализированной медицины.
Понимание основных механизмов заболевания имеет решающее значение для неврологических заболеваний, поскольку оно помогает в разработке потенциальных терапевтических стратегий. В то время как модели животных исторически были золотым стандартом для исследования заболеваний нервной системы, прямой перевод потенциальных методов лечения в клинических условияхчасто показывает ограниченный успех 1,2,3. Причинами отсутствия перевода являются отсутствие изменчивости генетического фона и мутаций у мышей, неполное отображение фенотипов заболеваний и изменение чувствительности к лекарственным препаратам или досирование у пациентов, которые не хорошо изображены в инбредных штаммах мыши. Кроме того, для многих редких неврологических расстройств, нет или несколько моделей животных доступны. Изучение механизмов заболевания непосредственно в соответствующих типах клеток человека может облегчить исследования и улучшить перевод в клинику. При расстройствах ЦНС первичные клетки человека трудно извлечь и представляют собой весьма ограниченный источник, поскольку биопсия является инвазивной или может быть извлечена только после смерти на конечной стадии заболевания. За последние 15 лет развитие технологии клеточного перепрограммирования быстро расширило возможности моделирования неврологических и нейродегенеративных заболеваний человека в пробирке.
Традиционные методы перепрограммирования клеток включают перепрограммирование фибробластов или других типов клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), способные дифференцироваться в типы клеток из всех трех слоевмикробов 4. Такахаси и Яманака были первыми, кто показала, что повторного выражения четырех факторов транскрипции стволовых клеток достаточно, чтобы перенаправить соматические клетки, чтобы стать iPSCs5. IPSCs можно более далее продифференцировать в специфически типы клетки. Тем не менее, недостаток этого процесса является то, что это трудоемкий и трудоемкий для создания и изоляции стабильных клонов стволовых клеток. Соматические мутации или специфические аберрансии материнской клетки также поддерживаются в клоне стволовых клеток и могут повлиять на результаты исследования6. Кроме того, все больше доказательств свидетельствует отом,что процесс перепрограммирования стволовых клеток стирает ценные эпигенетические изменения, которые могут повлиять намеханизмы клеточных заболеваний 4,7,8. В последние годы исследователи сосредоточились на модифицированных методах перепрограммирования, позволяющих более прямое поколение различных типов клеток, минуя плюрипотентноесостояние стволовых клеток 9,10,11,12 (рассмотрено в 13,14). Первоначальные прорывы показали в пробирке комбинаторной перепрограммирования фибробластов вкардиомиоциты 15,нейроны 16 игепатоциты 17 по эктопической экспрессии нескольких линий конкретных факторов транскрипции или микроРНК18. За этим последовали исследования непосредственно перепрограммирования клеток для моделирования неврологических расстройств19,20. Как уже упоминалось выше, такие протоколы прямого перепрограммирования или преобразования имеют потенциальные преимущества по сравнению с классическими протоколами iPSC, включая скорость и абляцию шага клональной изоляции. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что эти протоколы позволяют поддерживать большее количество эпигенетической информации, связанной с возрастом пациента и, вероятно, то же самое относится и кболезни соответствующих маркеров 7,8.
На сегодняшний день большинство исследований in vitro по неврологическим расстройствам было сосредоточено в первую очередь на нейронах. Тем не менее, хорошо известно, что другие типы клеток, такие как астроциты, микроглии и олигодендроциты играют важную роль в патологии заболеваний и прогрессировании нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD), амиотрофический боковой склероз (ALS), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Генттона (HD), рассеянный склероз (MS), и другие неврологические патологии, такие как синдром Ретта наркомания, эпилепсия, лизосомальные расстройства хранения, депрессия,мигрень и патологическая боль 21,22,23,24,25,26. Астроциты являются наиболее распространенным типом клеток в центральной нервной системе (ЦНС) и до недавнего времени, они были широко пренебречь с патологической точкизрения 7. В настоящее время известно, что они играют важную роль в поддержке почти всех гомеостатической функции здорового ЦНС. Кроме того, очевидно, что они имеют важное патологическое воздействие и очень ценны в понимании механизма заболевания и оценке терапевтических стратегий19.
В текущем описании мы подробно протокол для прямого преобразования человека пациента фибробластов в индуцированных нейрональных клеток прародителя (iNPCs) с использованием ретровирусных векторов, выражающие Яманака перепрограммирования факторов (Klf4, Oct3/4, Sox2 и c-Myc) и последующего воздействия неврализации средств массовой информации. Предыдущие исследования использовали различные комбинации транскрипционных факторов для прямого перепрограммирования нервных клеток (рассмотрены в 14), но факторы, используемые в описанном протоколе широко доступны либо в качестве плазмидов для в доме производства вирусных векторов, или как коммерчески доступны готовы пойти вирусной перепрограммирования комплектов. Полученные iNPCs могут быть дополнительно дифференцированы в индуцированных нейронов (iNs)27, олигодендроцитов (iOs)24 и астроцитов (iAS)19 для изучения их роли в неврологических заболеваний. Наш протокол не предполагает трудоемкого поколения iPSCs, которые наиболее доступные протоколы используют для получения человеческих астроцитов28. Приблизительно от 98% до 100% непосредственно перепрограммированных iNPCs может дифференцироваться в GFAP-положительныеастроциты 29 по сравнению с только 2% с помощью метода прямого преобразования из фибробластов в астроциты30. Недавно сравнительное транскриптомическое исследование с использованием нашего описанного метода перепрограммирования показало, что iNPCs перепрограммированы из донорских фибробластов может сохранить функции старения на транскрипционные и функциональный уровень похож на возрастных посмертных астроцитов и первичныхастроцитов 29. Таким образом, этот протокол преобразования является мощным инструментом для изучения механизмов заболевания и оценки новых терапевтических подходов к возрастным нейродегенеративным и неврологическим расстройствам.
Здесь мы описываем протокол, используемый для генерации iNPCs и дальнейшей дифференциации в IAs, которые наиболее подходят для больших малых молекулярных анализов скрининга. Механизмы заболевания и тестирование на наркотики с помощью iAs могут быть сделаны с использованием различных методологий, таких как совместное использование культур с нейронами или метаболический и биохимический анализ. Преимуществом этой системы является скорость и простота обслуживания этих клеточных линий по сравнению с iPSCs. Кроме того, iNPCs могут быть заморожены небольшими порциями для дифференциации М.А., что облегчает тестирование на наркотики в постоянных условиях в течение длительных периодов времени. В целом, сравнение больших выборочных чисел становится возможным таким образом, что открывает двери для оценки терапевтического потенциала соединений в более широкой и более представительной популяции пациентов.
Таким образом, прямое преобразование является быстрым и простым методом для создания индуцированных нейронных клеток-предшественников из фибробластов кожи пациента. Этот метод выгоден из-за его скорости, а также большого количества генерируемых ячеек, которые просты в обслуживании. Кроме того, все больше доказательств свидетельствует о том, что методы прямого перепрограммирования удаляют меньше эпигенетических знаков по сравнению с классической технологией перепрограммирования iPSC, в результате чего окружающаясреда болезни остается более нетронутой 4,7,8. Дифференциация iNPCs к астроцитам очень прямо вперед и высоки воспроизводима даже между множественными независимымилабораториями 19,29,33. iNPCs могут быть заморожены небольшими порциями и разморожены непосредственно для целей дифференциации, что помогает уменьшить различия между экспериментами, так как число проходов может быть аналогичным. Астроциты играют решающую роль в прогрессировании заболевания во многих неврологических заболеваний и, следовательно, интересный тип клеток для работы. Астроциты могут быть использованы для механистических исследований, метаболических исследований или анализа на наркотики и, как правило, выращиваются как монослойные. Кроме того, астроциты могут быть объединены в системах совместной культуры с мышью или нейронов человека для оценки влияния астроцитов на выживание нейронов и морфологии, оба из которых являются хорошими считывания для тестированияна наркотики 34.
Для успешного использования этого протокола необходимо иметь в виду несколько моментов и потенциальных ограничений. Фибробласты кожи человека, например, сильно различаются по скорости деления клеток, а также ответ на вирусные векторы. Поскольку это не стандартизированные клеточные линии, они так же изменчивы, как и само человечество, каждая линия отличается. Что касается многих методов перепрограммирования, легче перепрограммировать фибробласты, которые имеют умеренную и быструю скорость деления клеток по сравнению с клетками, которые едва реплицируются. Скорость репликации может быть повлията на качество биопсии кожи и обработки себя, по проходу число фибробластов, а также обработки. При работе с первичными фибробластами кожи, важно, чтобы клетки не получить слишком плотной, чтобы избежать индукции сенесценции. Если фибробласты не растут хорошо, то лучше попробовать новый запас или нижний проход, хотя в некоторых случаях, само заболевание может также играть определенную роль. Деление клеток иногда может быть улучшено с помощью 15% или 20% FBS в фибробластных средствах массовой информации по сравнению со стандартными 10%.
Качество перепрограммирования вирусных векторов имеет большое значение для успеха. В наших руках ретровирусные векторы были более эффективными по сравнению с лентивирусными векторами или другими неинтегрировавными вирусами; однако это может зависеть от качества и чистоты вирусного вектора. Коммерческие ретровирусные наборы переносчиков обычно определяют концентрацию вирусного переносчика, а часто и множественность инфекции для определенной клеточной линии. Важно иметь в виду, что первичные фибробласты отличаются от клеточной линии, используемой компаниями для определения вирусного поглощения вектора. Кроме того, даже при заказе одного и того же коммерческого комплекта, различия между партиями является общим. Кроме того, поглощение вирусных векторов также варьируется между линиями фибробластовых клеток. Некоторые линии могут быть более чувствительными и, следовательно, транс индуцированные клетки могут умереть, в то время как другие клеточные линии могут быть более устойчивыми к вирусному поглощению. Таким образом, определение эффективности трансдукции для данной клеточной линии может быть важно, особенно если линия ячейки растет медленно или предыдущие попытки преобразования не увенчались успехом. В наших руках лучший способ оценить, сколько конкретного ретровирусного вектора необходимо для преобразования, это выполнить иммунофлуоресцентное окрашивание с несколькими разбавлениями вирусного вектора. Количество ячеек, выражающих трансген для каждого вектора, можно пересчитать с целью повышения эффективности трансдукции на 70% и выше. По нашему опыту, аналогичные MOIs могут быть использованы для большинства линий клеток однако МВД может быть скорректирована в случае необходимости.
Во время процесса преобразования крайне важно не разделить клетки слишком рано. Время, пока клетки не будут готовы к разделению, зависит от нескольких факторов, включая первичную линию клеток и ее характеристики, качество используемого вирусного вектора и качество мультимедиа. Важно отметить, что скорость успеха преобразования гораздо выше, когда клетки хранятся в высокой плотности. Даже если клетки начинают менять морфологию, лучше оставить клетки в первом хорошо дольше, чем расщепление их преждевременно. Если разделение происходит слишком рано преобразование может остановиться в своем прогрессе и привести клетки дифференцировать обратно в фибробластовой формы и поведения. Кроме того, разбавление их слишком рано может привести к более удлиненные тела клеток по сравнению с малых и компактных клеток органов NPC наблюдается ранее. Таким образом, первые расколы всегда должны быть консервативными; лучше держать клетки слишком плотными с 1:1 или 1:2 раскол по сравнению с разбавления их слишком много. Ожидается, что после первоначального раскола будет приведена в себя какая-то клеточная смерть. Следует отметить, что клетки всегда выглядят хуже (льстить) в первый день после расщепления, что нормально. Лучшие суждения о форме клеток должны быть сделаны через 2-3 дня. Важно отметить, что качество факторов роста и медиа-компонентов также имеет решающее значение. Важно подготовить небольшое количество средств массовой информации, содержащих факторы роста, с тем чтобы полностью подготовленные средства массовой информации использовались только в течение 5-7 дней максимум. Не держите средства массовой информации при комнатной температуре или 37 градусов по Цельсию в течение длительных периодов времени. Используйте быстро и хранить в холодильнике, как только средства массовой информации изменения выполняются. Кроме того, сохранение низкого объема мультимедиа на уровне 1 мл вместо 2 мл может помочь особенно для клеточных линий, которые более устойчивы к преобразованию. Если клетки потребляют средства массовой информации быстро, что можно наблюдать при изменении цвета мультимедиа от красного до желтого (скорость подкисления), отрегулируйте объем мультимедиа до 2 мл. Быстрое потребление средств массовой информации является позитивным признаком и часто наблюдается на более поздних стадиях преобразования наряду с увеличением распространения.
NPC также очень чувствительны к присутствию accutase в средствах массовой информации, и это очень важно, чтобы сохранить accutase инкубации времени короткий. Рекомендуем инкубационный период в 2-4 минуты, часто проверяйте клетки под микроскопом, чтобы увидеть, когда они отсоединились. Важно центрифугировать клетки после расщепления, чтобы удалить ферментную смесь из средств массовой информации. Важно также иметь в виду номер прохода, поскольку клеточные линии могут меняться при расширенном культивировании, что приводит к изменению профилей выражения. Таким образом, важно заморозить многие запасы клеток на ранних проходах. Клетки должны быть заморожены в 10% DMSO и 90% NPC сми и храниться в долгосрочной перспективе в жидком азоте. Из-за отсутствия сыворотки в этом средстве крайне важно обеспечить медленный замерзать с помощью замораживающих камер и после замораживания на ночь, немедленно перейти на жидкий азот. Хотя в этом протоколе не проводится клональный отбор, вполне возможно, что расширенное культивирование и пропуск приводит к естественному отбору исходной популяции клеток с благоприятным ростом и выживаемостью. Поэтому важно иметь в виду номер прохода и обработку при проведении экспериментов. Мы предпочитаем использовать нижние проходы для экспериментов, если это возможно, мы не превышаем проходные линии клеток более чем в 20 раз. Поскольку ННК быстро растут, большое количество запасов может быть заморожено на более низких проходах для экспериментов. Клеточные линии с особенно высокими темпами роста имеют более высокий риск подкисления средств массовой информации. Таким образом, по мере того, как клеточные линии растут с разной скоростью, количество средств массовой информации, возможно, потребуется корректировать в зависимости от распространения. Если клетки постоянно остаются в высококислых средствах массовой информации, это может повлиять на здоровье как контроля, так и линий клеток болезни. Это приводит к тому, что даже здоровые астроциты становятся реактивными, влияя на их использование в дальнейшей дифференциации и экспериментах.
Для дифференциации астроцитов, важно держать клетки на низкой плотности, как высокая плотность будет препятствовать клеткам от дифференциации, и они будут продолжать размножаться с более высокими темпами. Таким образом, плотность посева должна быть скорректирована для каждой клеточной линии в зависимости от скорости их распространения. Мы рекомендуем попробовать различные плотности посева и выполнять окрашивания / RT-PCR с астроцитов маркеров для обеспечения надлежащей дифференциации. Качество IAs можно оценить наряду со здоровым контролем с помощью совместного анализа культуры с нейронами. При условии, что патология заболевания не приводит к реактивному фенотипу, нейроны должны оставаться жизнеспособными при контакте с МИ в течение нескольких дней. Астроцитов морфология может сильно варьироваться между отдельными клеточными линиями и может быть влияние фенотипа болезни, а также. Кроме того, при заболеваниях, когда астроциты сильно поражены, они могут показать реактивный фенотип с большими, удлиненными расширениями.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим всех пациентов и здоровых добровольцев за то, что они пожертвовали критические образцы для научных исследований. Кроме того, мы благодарим Рошель Родриго за постоянную экспертную техническую помощь в области тканевой культуры и Лауру Феррайуоло за независимое подтверждение техники в ее лаборатории в качестве сотрудника. Эта работа получила финансирование от Национальных институтов США здравоохранения Гранты R01 NS644912-4 и RC2 NS69476-01 (В A.L.S.) и Packard Центр ALS Research Грант P2ALS и помощь ссылка фонда. K.M также получил финансирование от Швейцарского национального научного фонда, а также премии молодых исследователей развития от мышечной дистрофии ассоциации, Rett синдром научно-исследовательский фонд и семьи SCN2A фондов.
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |