JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

Published: June 10, 2021
doi:
10.3791/62016
, , , , , ,
1Center for Gene Therapy,The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2College of Medicine, The Ohio State University

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לתכנת מחדש פיברובלסטים אנושיים שמקורם בעור לתאי אב עצביים המושרים (iNPCs), ואת הבידול הבא שלהם לאסטרוציטים המושרים (iAs). שיטה זו מובילה לייצור מהיר וניתן לשחזור של iNPCs ו- iAs בכמויות גדולות.

Abstract

מחקר על הפרעות נוירולוגיות מתמקד בעיקר בהשפעה של נוירונים על מנגנוני המחלה. זמינות מוגבלת של מודלים של בעלי חיים משפיעה קשות על המחקר של תרומות ספציפיות לסוג התא למחלות. יתר על כן, מודלים של בעלי חיים בדרך כלל אינם משקפים שונות במוטציות ובקורסי מחלות הנראים בחולים אנושיים. שיטות תכנות מחדש ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSCs) חוללו מהפכה במחקר הספציפי למטופל ויצרו כלים יקרי ערך לחקר מנגנוני המחלה. עם זאת, לטכנולוגיית iPSC יש חסרונות כגון זמן, מחויבות לעבודה, סלקטיביות שיבוטים ואובדן סמנים אפיגנטיים. שינויים אחרונים של שיטות אלה מאפשרים יצירה ישירה יותר של שושלת תאים או סוגי תאים ספציפיים, תוך עקיפת בידוד שיבוטים או מצב תאי גזע פלוריפוטנטיים. פיתחנו שיטת המרה ישירה מהירה כדי ליצור תאי אב עצביים המושרה (iNPCs) מן העור fibroblasts ניצול וקטורים רטרו-ויראלי בשילוב עם מדיה עצבית. ניתן להבדיל בין iNPCs לנוירונים (iNs) אוליגודנדרוציטים (iOs) ואסטרוציטים (iAs). ייצור iAs מקל על בדיקות מהירות של תרופות ומנגנון מחלות כהבחנה מ- iNPCs לוקח רק 5 ימים. יתר על כן, IAs קל לעבוד עם נוצרים באוכלוסיות טהורות במספרים גדולים. פיתחנו בדיקה משותפת הניתנת לשחזור באמצעות נוירונים GFP+ עכבר ו- IAS נגזר המטופל כדי להעריך אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות עבור הפרעות נוירולוגיות ונוירודגנרטיביות רבות. חשוב לציין, מבחני iA ניתנים להרחבה לפורמט של 384 באר המאפשר הערכה של מולקולות קטנות מרובות בצלחת אחת. גישה זו מאפשרת הערכה טיפולית בו זמנית של קווי תאים מרובים של המטופל עם רקע גנטי מגוון. ייצור ואחסון קלים של IAs והיכולת לסנן תרכובות מרובות במבחן אחד הופכים מתודולוגיה זו להתאמה לרפואה מותאמת אישית.

Introduction

הבנת מנגנוני המחלה הבסיסית היא קריטית למחלות נוירולוגיות כפי שהיא מסייעת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. בעוד מודלים בעלי חיים היו היסטורית תקן הזהב לחקר מחלות של מערכת העצבים, התרגום הישיר של טיפולים פוטנציאליים לתוך הגדרה קלינית לעתיםקרובותמראה הצלחה מוגבלת 1,2,3. הסיבות לחוסר התרגום הן חוסר שונות של רקע גנטי ומוטציות בעכברים, תצוגה חלקית של פנוטיפים של מחלות ושינוי ברגישות לסמים או מנון בחולים אנושיים שאינם מצולמים היטב בזני עכבר מולדים. יתר על כן, עבור הפרעות נוירולוגיות נדירות רבות, אין או כמה מודלים בעלי חיים זמינים. לימוד מנגנוני מחלה ישירות בסוגי תאים אנושיים רלוונטיים יכול להקל על המחקר ולשפר את התרגום למרפאה. עבור הפרעות מערכת העצבים המרכזית, תאים אנושיים ראשוניים קשה לאחזר ולייצג מקור מוגבל מאוד כמו ביופסיות הם פולשניים או ניתן לאחזר רק לאחר המוות בשלב הסופי של המחלה. ב -15 השנים האחרונות, הפיתוח של טכנולוגיית תכנות מחדש הסלולר הרחיב במהירות את היכולת מודל מחלות נוירולוגיות ונוירודגנרטיביות אנושיות במבחנה.

שיטות מסורתיות של תכנות מחדש של תאים כרוכות בתכנות מחדש של פיברובלסטים או סוגי תאים אחרים לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSCs) המסוגלים להבדיל לסוגי תאים מכל שלוש שכבות הנבט4. טקהאשי וימאנאקה היו הראשונים להראות כי ביטוי מחדש של ארבעה גורמי שעתוק תאי גזע מספיק כדי לנתב מחדש תאים סומטיים כדי להפוך IPSCs5. לאחר מכן ניתן להבדיל עוד יותר בין IPSCs לסוגי תאים ספציפיים. עם זאת, החיסרון של תהליך זה הוא שזה עבודה אינטנסיבית זמן רב כדי ליצור ולבודד שיבוטים תאי גזע יציבים. מוטציות סומטיות או אברנציות ספציפיות של תא האם נשמרות גם בשיבוט תאי הגזע ויכולות להשפיע על תוצאות המחקר6. בנוסף, הגדלת הראיות מרמזת כי תהליך התכנות מחדש לתאי גזע מוחק שינויים אפיגנטיים בעלי ערך שיכולים להשפיע עלמנגנוניהמחלה התאית 4,7,8. בשנים האחרונות התמקדו החוקרים בשיטות תכנות מחדש מותאמות המאפשרות יצירה ישירה יותר של סוגי תאים שונים תוך עקיפת מצב תאי הגזע הפלוריפוטנטיים9,10,11,12 (נבדק ב 13,14). פריצות דרך ראשוניות התגלו במבחנה קומבינטורית תכנות מחדש של fibroblasts כדי cardiomyocytes15, נוירונים16 ו hepatocytes17 על ידי ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק ספציפיים לשושלת מרובים או microRNAs18. זה היה ואחריו מחקרים ישירות לתכנת מחדש תאים מודל הפרעות נוירולוגיות19,20. כפי שהוזכר לעיל, לפרוטוקולי תכנות או המרה ישירים כאלה יש יתרונות פוטנציאליים על פני פרוטוקולי iPSC קלאסיים כולל מהירות ואבלציה של שלב בידוד השיבוטים. יתר על כן, הראיות מצביעות על כך שפרוטוקולים אלה מאפשרים לשמור על כמות גדולה יותר של מידע אפיגנטי הקשור לגיל המטופל וסביר להניח שאותו הדבר נכון לגבי סמנים רלוונטיים למחלות7,8.

עד כה, רוב המחקר במבחנה על הפרעות נוירולוגיות התמקד בעיקר נוירונים. עם זאת, ידוע כי סוגי תאים אחרים כגון אסטרוציטים, microglia ו oligodendrocytes לשחק תפקיד קריטי בפתולוגיה של מחלות והתקדמות של הפרעות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (לספירה), טרשת לרוחב Amyotrophic (ALS), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), טרשת נפוצה (MS), ופתולוגיות נוירולוגיות אחרות כגון תסמונת רט (RTT), הפרעות שינה, התמכרות, אפילפסיה, הפרעות אחסון ליזוזומליות, דיכאון, מיגרנה וכאבפתולוגי 21,22,23,24,25,26. אסטרוציטים הם סוג התא הנפוץ ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS) ועד לאחרונה, הם הוזנחו באופן נרחב מנקודת מבט פתולוגית7. כיום ידוע שיש להם תפקיד קריטי בתמיכה כמעט בכל הפונקציות ההומיוסטטיות של מערכת העצבים המרכזית הבריאה. בנוסף, ברור כי יש להם השפעה פתולוגית חשובה והם בעלי ערך רב בהבנת מנגנון המחלה והערכת אסטרטגיות טיפוליות19.

בתיאור הנוכחי, אנו מפרטים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים של חולים אנושיים לתאי אב עצביים המושרים (iNPCs) באמצעות וקטורים רטרו-ויראליים המבטאים את גורמי התכנות מחדש של יאמאנאקה (Klf4, Oct3/4, Sox2 ו- c-Myc) וחשיפה לאחר מכן למדיה עצבית. מחקרים קודמים השתמשו בשילובים שונים של גורמים שעתוק עבור תכנות מחדש ישיר לתאים עצביים (נבדק ב 14), אבל הגורמים המשמשים בפרוטוקול המתואר זמינים באופן נרחב או כמו plasmids לייצור הבית של וקטורים ויראליים, או כמו מסחרית זמין מוכן ללכת ערכות תכנות ויראלי. iNPCs וכתוצאה מכך ניתן להבדיל עוד יותר לתוך נוירונים המושרה (iNs)27, oligodendrocytes (iOs)24 ואסטרוציטים (iAS)19 ללמוד את תפקידם במחלות נוירולוגיות. הפרוטוקול שלנו אינו כרוך בדור גוזל זמן של iPSCs אשר רוב הפרוטוקולים הזמינים לנצל נגזרת של אסטרוציטים אנושיים28. כ 98% עד 100% של iNPCs מתוכנת ישירות יכול להבדיל לתוך אסטרוציטים חיוביים GFAP29 לעומת רק 2% באמצעות שיטת המרה ישירה מ fibroblasts כדי אסטרוציטים30. לאחרונה, מחקר תעתיק השוואתי באמצעות שיטת התכנות מחדש המתוארת שלנו הראה כי iNPCs מתוכנת מחדש מ fibroblasts התורם יכול לשמור על תכונות הזדקנות ברמה שעתוק ופונקציונלי דומה לגיל תואם אסטרוציטים נתיחה שלאחר המוות ואסטרוציטים ראשוניים29. לכן, פרוטוקול המרה זה הוא כלי רב עוצמה לחקור מנגנוני מחלה ולהעריך גישות טיפוליות חדשניות להפרעות נוירודגנרטיביות ונוירולוגיות הקשורות לגיל.

כאן אנו מתארים את הפרוטוקול המשמש ליצירת iNPCs ובידול נוסף לתוך iAs, שהם המתאימים ביותר עבור מבחני הקרנה מולקולריים קטנים בקנה מידה גדול יותר. מנגנוני מחלות ובדיקות סמים עם iAs יכולים להיעשות באמצעות מתודולוגיות שונות כגון תרבויות משותפות עם נוירונים או ניתוח מטבולי וביוכימי. היתרון של מערכת זו הוא המהירות וקלות התחזוקה של קווי תאים אלה בהשוואה ל- iPSCs. יתר על כן, iNPCs ניתן להקפיא במנות קטנות עבור בידול iAs אשר מקל על בדיקות סמים בתנאים קבועים על פני תקופות ממושכות של זמן. בסך הכל, השוואה של מספרי מדגם גדולים יותר הופכת לאפשרית בדרך זו אשר פותחת את הדלת להערכת הפוטנציאל הטיפולי של תרכובות באוכלוסיית חולים גדולה ומייצגת יותר.

Protocol

מדיה מגיב סכום שיש לערבב ריכוז סופי (%) תקשורת פיברובלסט DMEM, גלוקוז גבוה, גלוטמקס 500 מ”ל 89 סרום שור עוברי 50 מ”ל 10 אנטיביוטי אנטי-מיקוטי 5 מ”ל 1 מדיה בסיסית DMEM/F12 + גלוטמקס 500 מ”ל 97 N-2 5 מ”ל 1 B-27 5 מ”ל 1 אנטיביוטי אנטי-מיקוטי 5 מ”ל 1 מדיית המרה מדיה בסיסית 50 מ”ל 99.9 FGF μL אחד 0.02 (20 ng/mL) EGF (EGF) μL אחד 0.02 (20 ng/mL) הפארין 50 μL 0.1 (5 מיקרוגרם / מ”ל) תאי אב עצביים (NPC) מדיה DMEM/F12 + גלוטמקס 500 מ”ל 96.9 N-2 5 מ”ל 1 B-27 5 מ”ל 1 אנטיביוטי אנטי-מיקוטי 5 מ”ל 1 FGF 10 אול על 0.002 אסטרוציטים מדיה DMEM, גלוקוז גבוה, גלוטמקס 500 מ”ל 89 סרום שור עוברי 50 מ”ל 10 אנטיביוטי אנטי-מיקוטי 5 מ”ל 1 N-2 1 מ”ל 0.2 יש לסנן מדיה לאחר ערבוב כל הרכיבים. מדיית המרה (עם גורמים) חייבת להיות מוכנה טרי מדי שבוע. שולחן 1. מתכוני מדיה עבור כל סוגי התאים הכלולים בפרוטוקול. יש לסנן מדיה לאחר ערבוב כל הרכיבים עם מערכת סינון ואקום סטרילית עבור כמויות גדולות או מזרק ומסנני מזרק 0.2 אום. מדיית המרה (עם גורמים) חייבת להיות מוכנה טרי מדי שבוע. 1. המרה ישירה של פיברובלסטים אנושיים בוגרים לתאי אב עצביים הערה: ניתן לסקור ציר זמן סכמטי של פרוטוקול זה ב- Meyer (2014)19. השתמש פיברובלסטים העור האנושי העיקרי שניתן להשיג בנקים תאים או ביופסיות העור31. תאי תרבות ב 37 °C (69 °F) בחממה 5% CO2 תרבית רקמות. תאי מעבר עבור לפחות 1-2 קטעים לאחר הפשרה לפני השימוש בניסוי. ברגע שהתאים מוכנים, מצפים באר של צלחת 6 באר עם פיברונקטין אנושי (1:200 מדולל ב PBS) בטמפרטורת החדר במשך 15-20 דקות. כאשר התאים מוכנים להיות מצופים, להסיר את fibronectin מן המנה ומיד להוסיף פתרון התא או 2 מ”ל של מדיה fibroblast (טבלה 1) – לא נותנים את המנה להתייבש לפני הוספת מדיה. תלוי כמה מהר התאים גדלים, צלחת 150,000 (גדל במהירות) – 200,000 (גידול איטי) fibroblasts בשתי בארות של פיברונקטין אנושי מצופה 6-באר צלחת כל אחד.הערה: התאים צריכים להיות סביב 70% confluent עבור transduction ויראלי כדי להיות מסוגל לשמור אותם באותה צלחת במשך כמה ימים נוספים לאחר transduction. זה יכול להיות מועיל זרע בשתי צפיפויות שונות על מנת לקבל בחירה למחרת להמרה. יום לאחר הזריעה, בדוק את הפיברובלסטים מתחת למיקרוסקופ ואמת את צפיפות התאים (בין 70-85%) ואפילו זריעה ברחבי הבאר לקבלת תוצאות אופטימליות. מתמר באר אחת עם כל ארבעת הווקטורים הרטרו-ויראליים (Oct3/4, Klf4, Sox2 ו- c-Myc) – השתמש בריבוי של זיהום (MOI) של 10 לגידול מהיר או 15 עבור פיברובלסטים הגדלים לאט (יעילות התמרה צריכה לעלות על 70% או יותר תאים חיוביים עבור כל וקטור). הוסף מדיום פיברובלסט רגיל לתערובת ויראלית לנפח כולל של 1 מ”ל לבאר והדגירה לילה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמת CO2 5%. השאירו את התאים השניים שאינם מטופלים היטב והחזירו תאים לאינקובטור של תרבית הרקמות.הערה: וקטורים Retroviral ניתן לרכוש על ידי ספק או עשה בתוך הבית, פרוטוקולים זמינים באינטרנט32. יום לאחר התמרות, לשטוף תאים 1x עם PBS ולהוסיף 1 מ”ל של מדיום fibroblast טרי. למחרת, שנה בינוני למדיום המרה. לשטוף תאים 1x עם PBS כדי להיפטר מדיום שרירן שיורית, ולאחר מכן להוסיף 1 מ”ל של מדיום המרה. שנה את המדיה של הבאר הלא מטופלת גם למדיית המרה.הערה: כמה שינויים מורפולוגיים ניתן לראות גם על ידי שינוי המדיה על fibroblasts שלא קיבלו טיפול וקטור רטרו-ויראלי, ובכך בעל באר מטופלת (אופציונלי) יהיה מועיל בעת קביעת ההשפעות של וקטורים ויראליים. תאים צריכים להתחיל לשנות מורפולוגיה 2-4 ימים לאחר המעבר למדיית המרה. שימו לב לתאים שמתחת למיקרוסקופ וצפו בשינויים במורפולוגיה (איור 1). מדיה סלולרית צריכה להיות מוחלפת מדי יום לאורך כל תהליך ההמרה (1-2 מ”ל של מדיית המרה, טבלה 1) ולתרבות iNPC הבאה. לשנות בינוני על ידי הסרת בזהירות 70% של מדיום מן הבאר תוך הקפדה כי התאים נשארים מכוסים הנותרים 30% של מדיה.הערה: מדיה עם גורמי גדילה זה צריך להיות נצרך בתוך 1 שבוע של הכנה. המשך להתבונן בתאים ולשנות מדיה מדי יום (1-2 מ”ל של מדיית המרה). קווי תאים מסוימים מתחילים ליצור תצורות עגולות רופפות מוגבהות הגדלות בכדור כמו מבנים או כדורים עצביים רופפים(איורים משלימים 1 ו-19,33). היזהר לא לנתק תאים אלה. אם הכדורים להתנתק, הם יכולים להיאסף מחדש מצופה פיברונקטין חדש מצופה היטב של צלחת 6-well.הערה: אם הם מורחבים בכוחות עצמם, התאים יפחיתו את המגוון בהשוואה ללוח הראשוני ועשויים לייצג קו תא שונה במובהק. מומלץ לשלב תאים אלה עם שאר התאים המומרים בסיבוב הפיצול הבא. לאחר כ- 5-6 ימים במדיית המרה (עד 12 ימים עבור קווי תאים קשים) או כאשר התאים הופכים צפופים מאוד, מעבר אותם 1:2 או מקסימום 1:3.הערה: חשוב מאוד לשמור על התאים בצפיפות גבוהה לאורך כל תהליך ההמרה. 2. המרה והליך פיצול iNPC לחמם את פתרון ניתוק התא (למשל, Accutase) ולמעיל מספר מתאים של בארות של 6-באר עם fibronectin (1:200 ב PBS, 1 מ”ל של נפח ציפוי) במשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר. ציפוי Fibronectin יכול להיות ארוך יותר ללא השפעה שלילית, אבל יש לנקוט זהירות כדי לא לקצר את זמן הציפוי. לשטוף תאים בזהירות עם PBS מבלי לנתק את כל התאים (להשתמש בקיר של הבאר כדי להחיל PBS בעדינות על התאים). הסר בזהירות PBS עם פיפטות או על ידי שאיפה. הוסף 0.5 מ”ל של פתרון ניתוק תאים והדגירה 2-3 דקות ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמות. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שרוב התאים התנתקו. אם כל התאים ירדו, הוסף 2 מ”ל של מדיית המרה טרייה ופיפט בעדינות למעלה ולמטה 2-3 פעמים כדי לנתק גושים (במידת הצורך). לאסוף את התאים בצינור 15 מ”ל ולהוסיף 3 מ”ל נוספים של מדיה כדי לדלל עוד יותר את פתרון ניתוק התא. לשטוף את הבאר עם מדיה נוספת הראשון כדי להבטיח את כל התאים נאספו. צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 200 x גרם בטמפרטורת החדר.הערה: המרת תאים או iNPCs רגישים מאוד לנוכחות של פתרון ניתוק תאים במדיה. זה בהחלט הכרחי כדי להסיר את האנזים שיורית על ידי צנטריפוגה ונסיגה של supernatant. הסר supernatant מן גלולת התא ו resuspend התאים ב 1 מ”ל של מדיום טרי. בעדינות פיפטה למעלה ולמטה 2-3 פעמים כדי לפתור גושי תאים. הסר fibronectin מ מצופה 6-בארות ולהוסיף 1 מ”ל של מדיה טרייה לכל באר מיד (לא נותנים fibronectin יבש). עבור יחס פיצול של 1:2, להוסיף 0.5 מ”ל של השעיית התא בבאר אחת והשני 0.5 מ”ל בבאר שנייה. תאי תרבות ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמות. להפיץ את התאים על ידי טלטול בעדינות 6-באר בכיוון צפון-דרום מזרח-מערב (לא מעגלי) ולשים אינקובטור תרבית רקמות. שים לב לתאים מתחת למיקרוסקופ למחרת ושנה מדיה (1-2 מ”ל). שנה מדיה מדי יום עד שהתאים יהיו מוכנים לפיצול שוב.הערה: בשלב זה, התפשטות התאים צריכה להתחיל להאיץ, והתאים צריכים להיות מוכנים לפיצול שני בתוך 2-3 ימים (4 ימים עבור קווי גידול איטיים מאוד). בפיצול חדש זה, זרע באר אחת של תאים במדיית המרה והשני גם במדיה NPC המכיל רק FGF בריכוז מוגבר ללא EGF / הפרין (טבלה 1).הערה: קווי תא מסוימים מגיעים למצב של קיפאון במדיית המרה לאחר כעשרה ימים ומעבר למדיית NPC עשוי לסייע בצמיחת התאים. בנוסף, NPCs יש צורה ספציפית יותר, קטנה יותר, כאשר גדל במדיה NPC19. בשלב זה, iNPCs מוכנים לבידול ושימוש נוסף. המשך לשנות מדיה (1-2 מ”ל) של iNPCs מדי יום. הרחב NPCs למנות 10 ס”מ על ידי שילוב של שתיים או שלוש בארות משולבות של 6 באר. נפח המדיה עבור מנות 10 ס”מ הוא בדרך כלל 12-15 מ”ל. בפיצול הבא, להרחיב עוד יותר תאים אלה לשלוש או ארבע מנות 10 ס”מ (12-15 מ”ל של מדיה) במשך דורות של מספר גדול של מלאי תאים. מנות 10 ס”מ מחולקות בדרך כלל ב 1:3 או 1:4 כל 3-4 ימים בהתאם לקצב התפשטות. 3. יצירת אסטרוציטים המושרים מ- NPCs כדי להפוך אסטרוציטים מ- iNPCs טריים, זרע iNPCs (ב 10 ס”מ פיברונקטין מצופה לוחות) ישירות 10 מ”ל אסטרוציטים בינוני(טבלה 1) כךשהם סביב 10% confluency למחרת. תאי תרבות ב 37 °C (69 °F) בחממה 5% CO2 תרבית רקמות.הערה: צפיפות הזריעה המומלצת היא בדרך כלל 50 μL של ההשעיה מחדש של התא של צלחת 10 ס”מ של NPCs, בתנאי שהם מדוללים לנפח סופי בהתבסס על יחס הפיצול שלהם (למשל, 3 מ”ל עבור פיצול 1:3, 4 מ”ל עבור פיצול 1:4, וכו ‘). שנה מדיום (מדיית אסטרוציטים של 10 מ”ל) של IAs שלושה ימים לאחר הציפוי. שמור על התאים מבדילים במשך 5-7 ימים.הערה: iAs אינם סובלים קטעים מרובים היטב, ולכן עדיף לעשות אסטרוציטים טריים בכל פעם שאתה לפצל את NPCs. כדי לזרוע ניסויים, פצל את האסטרוציטים באמצעות פתרון טריפסין או ניתוק תאים כמתואר בשלבים 2.1-2.7. צפיפויות זריעה מומלצות כלולות בטבלה 2. סוג לוח אסטרוציטים לבאר 384 באר 2500 96 באר 10000 24 באר 40000 6 באר 150000 שולחן 2. צפיפות זריעה מומלצת של IAs לכל אזור צלחת. מספר אופייני של iAs זרעים כדי ליצור monolayer על צלחות תרבית הרקמה הנפוצה ביותר. 4. הכנה והפשרה של מנות לבידול אסטרוציטים ממניות NPC קפואות (אלטרנטיבה לשלב 3) הערה: כחלופה לשמירה על iNPCs בתרבות, אסטרוציטים יכולים גם להיות מיוצרים ישירות ממלאי קפוא. כדי לעשות זאת, iNPCs מוקפאים בחלקים קטנים יותר. טבלה 3 מציגה כרכים מוצעים להקפאה והפשרה של חלקים לתבשיל של 10 ס”מ המכיל 10 מ”ל של מדיה אסטרוציטים. גודל מנה השעיית תאים (μL) הקפאת מדיה (μL) נפח כולל (μL) מפשירו לתוך פי 4 400 400 800 שתי מנות 10 ס”מ פי 2 200 200 400 מנה אחת של 10 ס”מ שולחן 3. הוראות כיצד לחלק iNPC כדי ליצור iAs. חלק מהשעיית iNPC ומדיית הקפאה כדי ליצור חלקים. שים לב כי ריכוז DMSO הסופי הוא 10% כאשר השעיית התא מעורבב עם מדיה הקפאה. כדי להפוך אסטרוציטים ממלאי iNPC קפוא, להסיר בקבוקון מלאי חלק ממיכל אחסון חנקן נוזלי במהירות להפשיר ב 37 °C (69 °F). ברגע שהתאים מופשרים, פתרון תא פיפטה בצינור 15 מ”ל המכיל 5 מ”ל אסטרוציטים מדיה. צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 200 x גרם וטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו resuspend ב 1 מ”ל של מדיום אסטרוציטים טריים. מוסיפים 9 מ”ל של אסטרוציטים טריים בינוניים לצלחת פיברונקטין מצופה 10 ס”מ ומוסיפים 1 מ”ל של תמיסת תאים. מפיץ בעדינות תאים בתנועה צפון-דרום-מזרחית-מערבית. תאי תרבות ב 37 °C (69 °F) בחממה 5% CO2 תרבית רקמות.

Representative Results

פרוטוקול זה מאפשר דור מהיר וקל של iNPCs ישירות מן העור האנושי fibroblasts באמצעות retroviruses המכיל את גורמי Yamanaka. שיטה זו מאפשרת לעקוף את מצב תאי הגזע ואת הצורך בבחירת שיבוטים, ובכך למנוע וריאציה שיבוט. צעדים חשובים שיש לזכור בזמן שהתאים עוברים את תהליך ההמרה הם צפיפות הזריעה הפיברובלסטית, ה- pH של המדיה ושמירה על התאים במפגש אופטימלי. באיור 1ניתן למצוא דוגמאות לשינויים מיטביים במפגשי פיצול ובמורפולוגיה במהלך תהליך ההמרה . איור 1. תמונות מייצגות של תהליך ההמרה לאחר הוספת התמהיל הרטרו-ויראלי של גורמי יאמאנקה. פיברובלסטים נזרעו והתעללו עשרים וארבע שעות מאוחר יותר עם גורמי יאמאנאקה. יומיים לאחר וירוס פוסט (DPV), המדיה שונתה למדיית המרה. התאים היו מתורבתים במדיית המרה עד שהיו מוכנים למעבר (13 DPV). תאים נזרעו מעבר פוסט כדי להגיע 80% מפגש למחרת (14 DPV). הקטעים הבאים שמרו על צפיפות זו עד שתאי האב העצביים יתחילו לעבור במהירות. סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר. לאחר השלמת תהליך ההמרה, NPCs יציגו ביטוי מופחת מאוד או ללא ביטוי של סמנים ומורפולוגיה פיברובלסטים, ויבטאו סמני תא ספציפיים ל- NPC (איור 2). יתר על כן, הם יכולים לשמש גם ליצירת קווי תא שונים, כמו iNs, iOs, ו- iAs. איור 2. תאים העוברים את תהליך ההמרה מבטאים סמנים ספציפיים לתאים. חולי פיברובלסטים (A), תאי אב עצביים המושרים (iNPCs (B) ותאי אסטרוציטים המושרים (iAs (C) נזרעו על כיסויי זכוכית בצלחת 24 היטב רקמות שטופלו. התאים היו immunostained עבור: סמני תאים ספציפיים fibroblast (A), Vimentin (ירוק) ו- TE7 (אדום), סמן תא ספציפי iNPC (B), נסטין (אדום), ו- iAs תא סמן (C) GFAP (סגול) ו iNPC סמן נסטין (ירוק). סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. מניסיוננו, iAs בפרט הם בעלי ערך רב עבור בדיקות מנגנון תרופות ומחלות כפי שהם יכולים להיווצר באוכלוסיות טהורות (98% או יותר GFAP תאים חיוביים29) במספרים גדולים לשחזור. iAs ניתן להבדיל iNPCs על ידי לקיחת aliquot קטן של תאים במהלך פיצול או חלק iNPC קפוא בעבר ציפוי ישירות במדיה אסטרוציטים. שיקולים חשובים בתהליך זה הם שמירה על צפיפות הזריעה הראשונית של INPCs נמוכה (איור 3 ואיור 4), שכןהוכח כי צפיפות גבוהה מעכבת את תהליך הבידול (איור 4)ומקדישה תשומת לב נוספת ל- pH של המדיה, שכן חומציות יכולה להפעיל אפילו אסטרוציטים בריאים. איור 3. תמונות מייצגות של תהליך יצירת IAs מ- iNPCs. רכיבי iNPCs נזרעים במדיית אסטרוציטים (טבלה 1) בצפיפות זריעה נמוכה. צפיפות זריעה טובה היא כ -10% ביום הראשון לאחר זריעה (DPS) (שמאל); עם זאת, צפיפות זו יכולה להיות מותאמת על פי קצב הצמיחה של תאים. מורפולוגיה טיפוסית של IAs ניתן לראות לאחר 5 DPS (באמצע). במקרים מסוימים, מורפולוגיה אסטרוציטים חריגה ניתן לראות, עם הרחבות ארוכות, קוצניות. שינוי זה מעיד על הפעלת אסטרוציטים והוא יכול להיות משני למצב המחלה או טכניקות culturing שגוי (זכות). סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר. איור 4. צפיפות זריעת iNPC משפיעה על יעילות הבידול של IAs. קווי iNPC בקרה נזרעו בצפיפות נמוכה (A) וגבוהה (B) במדיה אסטרוציטים כדי להדגים השפעות של צפיפות זריעה על בידול. 5 DPS, קו הצפיפות הנמוכה ביטא סמנים ספציפיים לאסטרוציט, בעוד שקו הצפיפות הגבוהה מציג תערובת של סמני iNPC ו- iAs עם מורפולוגיה מסומנת דמוית iNPC. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. איור משלים 1. נתונים נוספים על תהליך ההמרה לאחר הוספת התמהיל הרטרו-ויראלי של גורמי יאמאנקה. תמונות של תהליך ההמרה ב- 12 DPV (יום אחד לפני המעבר) ו- 19 DPV (6 ימים לאחר המעבר). שים לב להבדל במורפולוגיה בין תאים לפני ואחרי המעבר, ב 12 תאי DPV יש מורפולוגיה מבנה דמוי כדור. לאחר מעבר ומספר ימים בתאי מדיית המרה (טבלה 1) מתחילים להציג מורפולוגיה דמוית NPC. סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר.

Discussion

לסיכום, ההמרה הישירה היא שיטה מהירה וקלה ליצירת תאי אב עצביים המושרים מפיברובלסטים בעור המטופל. שיטה זו היא יתרון בגלל המהירות שלה, כמו גם את המספר הגדול של תאים שנוצרו כי הם קלים לתחזוקה. יתר על כן, הגדלת הראיות עולה כי שיטות תכנות מחדש ישיר להסיר סימנים אפיגנטיים פחות לעומת טכנולוגיית תכנות מחדש iPSC קלאסי, ולכן משאיר את סביבת המחלה שלם יותר4,7,8. הבידול של iNPCs לאסטרוציטים הוא ישר מאוד קדימה מאוד לשחזור אפילו בין מעבדות עצמאיות מרובות19,29,33. iNPCs ניתן להקפיא בחלקים קטנים מופשר ישירות למטרות בידול, אשר מסייע להפחית את השונות בין ניסויים מאז מספרי המעבר יכול להישמר דומה. אסטרוציטים ממלאים תפקיד מכריע בהתקדמות המחלה במחלות נוירולוגיות רבות ולכן הם סוג תא מעניין לעבוד איתו. האסטרוציטים יכולים לשמש למחקרים מכניים, מחקרים מטבוליים או בדיקות סמים, והם בדרך כלל גדלים כמו monolayers. יתר על כן, אסטרוציטים ניתן לשלב במערכות תרבות משותפת עם עכבר או נוירונים אנושיים כדי להעריך את ההשפעה של אסטרוציטים על הישרדות עצבית מורפולוגיה, שניהם קריאות טובות עבור בדיקות סמים34.

על מנת להשתמש בפרוטוקול זה בהצלחה, יש לזכור כמה נקודות ומגבלות פוטנציאליות. פיברובלסטים העור האנושי למשל להשתנות מאוד בקצב חלוקת התא שלהם, כמו גם תגובה וקטורים ויראליים. מכיוון שאלה אינם קווי תאים מתוקננים, הם משתנים כמו האנושות עצמה, כל שורה שונה. באשר לשיטות תכנות מחדש רבות, קל יותר לתכנת מחדש פיברובלסטים בעלי קצב חלוקת תאים בינוני עד מהיר לעומת תאים שבקושי משכפלים. קצב השכפול יכול להיות מושפע על ידי איכות ביופסיה העור ועיבוד עצמו, על ידי מספר המעבר של fibroblasts, כמו גם טיפול. כאשר עובדים עם fibroblasts העור העיקרי, חשוב לא לתת לתאים לקבל צפוף מדי, כדי למנוע אינדוקציה של רגישות. אם fibroblasts לא לגדול היטב, עדיף לנסות מלאי חדש או מעבר נמוך יותר, אם כי במקרים מסוימים, המחלה עצמה יכולה גם לשחק תפקיד. חלוקת תאים לפעמים ניתן לשפר באמצעות 15% או 20% FBS במדיה fibroblast לעומת תקן 10%.

איכות הווקטורים הנגיפיים המתכננים מחדש היא בעלת חשיבות גבוהה להצלחה. בידינו, וקטורים רטרו-ויראליים היו יעילים יותר בהשוואה לווקטורים lentiviral או וירוסים אחרים שאינם משלבים; עם זאת, זה יכול להיות תלוי באיכות וקטור ויראלי וטוהר. ערכות וקטור רטרו-ויראלי מסחריות בדרך כלל מציינות את הריכוז הווקטורי הנגיפי ולעתים קרובות גם ריבוי של זיהום עבור קו תא מסוים. חשוב לזכור כי fibroblasts העיקרי שונה מקו התא בשימוש על ידי החברות כדי לקבוע ספיגה וקטורית ויראלית. יתר על כן, גם בעת הזמנת אותה ערכה מסחרית, וריאציה בין אצוות נפוצה. יתר על כן, ספיגת וקטורים ויראליים משתנה גם בין קווי תאים פיברובלסט. קווים מסוימים יכולים להיות רגישים יותר ולכן תאים שעברו חילוף עלולים למות, בעוד שקווי תאים אחרים עשויים להיות עמידים יותר בפני ספיגה נגיפית. לכן, קביעת יעילות התמרה עבור קו תא נתון יכול להיות חשוב במיוחד אם קו התא גדל לאט או ניסיונות המרה קודמים נכשלו. בידינו, הדרך הטובה ביותר להעריך כמה וקטור רטרו-ויראלי ספציפי נחוץ להמרה היא לבצע כתמים אימונופלואורסצנטיים עם מספר דילולים של הווקטור הנגיפי. לאחר מכן ניתן לספור את מספר התאים המבטאים את הטרנסג’ין עבור כל וקטור, במטרה לייעל התמרה של 70% ומעלה. מניסיוננו, MOIs דומים יכולים לשמש עבור רוב קווי התא אולם MOI ניתן להתאים במידת הצורך.

במהלך תהליך ההמרה, חיוני לא לפצל את התאים מוקדם מדי. הזמן עד שהתאים יהיו מוכנים לפיצול תלוי בגורמים רבים, כולל קו התאים הראשי ומאפייניו, איכות הווקטור הנגיפי המשמש ואיכות המדיה. חשוב לציין, שיעור ההצלחה של ההמרה הוא הרבה יותר גבוה כאשר התאים נשמרים בצפיפות גבוהה. גם אם התאים מתחילים לשנות מורפולוגיה, עדיף להשאיר את התאים בבאר הראשונה זמן רב יותר מאשר לפצל אותם בטרם עת. אם הפיצול מתרחש מוקדם מדי ההמרה יכולה לעצור את התקדמותה ולהוביל את התאים להבדיל בחזרה לצורה והתנהגות דמויי פיברובלסט. יתר על כן, דילול אותם מוקדם מדי יכול לגרום לגופי תאים מוארכים יותר בהשוואה לגופי התאים הקטנים והדחוסים של NPCs שנצפו בעבר. לכן, הפיצולים הראשונים צריכים תמיד להיות שמרניים; עדיף לשמור על התאים צפופים מדי עם פיצול 1:1 או 1:2 לעומת דילול אותם יותר מדי. מוות תאי כלשהו צפוי לאחר הפיצול הראשוני. שימו לב, התאים תמיד נראים גרועים יותר (מחמיאים) ביום הראשון לאחר הפיצול, וזה נורמלי. פסקי הדין הטובים ביותר על צורת התא צריך להיעשות 2-3 ימים מאוחר יותר. חשוב לציין, איכות גורמי הצמיחה ורכיבי המדיה היא קריטית גם כן. חשוב להכין כמויות קטנות של מדיה המכילה גורמי גדילה, כך המדיה מוכנה במלואה ישמש רק עבור 5-7 ימים מקסימום. אין לשמור את המדיה בטמפרטורת החדר או 37°C לפרקי זמן ממושכים. יש להשתמש במהירות ו במקרר מיד עם ביצוע שינוי המדיה. בנוסף, שמירה על נפח מדיה נמוך ב 1 מ”ל במקום 2 מ”ל יכול לעזור במיוחד עבור קווי תאים עמידים יותר להמרה. אם התאים צורכים את המדיה במהירות, אשר ניתן לראות על ידי שינוי בצבע המדיה טופס אדום לצהוב (קצב חומציות), להתאים את נפח המדיה עד 2 מ”ל. צריכת מדיה מהירה היא סימן חיובי ולעתים קרובות נצפתה בשלבים מאוחרים יותר של המרה לצד התפשטות מוגברת.

NPCs הם גם רגישים מאוד לנוכחות של accutase בתקשורת וחשוב מאוד לשמור על זמן הדגירה accutase קצר. אנו ממליצים על תקופת דגירה של 2-4 דקות, לבדוק תאים לעתים קרובות מתחת למיקרוסקופ כדי לראות מתי הם התנתקו. זה חיוני כדי צנטריפוגה התאים לאחר פיצול כדי להסיר את תערובת האנזים מן המדיה. חשוב גם לזכור את מספר המעבר, שכן קווי התאים יכולים להשתנות עם הכת המורחבת המובילה לשינוי פרופילי הביטוי. לכן, חשוב להקפיא מניות תאים רבים במעברים מוקדמים. יש להקפיא תאים ב- 10% DMSO וב- 90% במדיית NPC ולאחסן אותם לטווח ארוך בחנקן נוזלי. בשל חוסר סרום במדיה זו זה קריטי כדי להבטיח הקפאה איטית באמצעות תאי הקפאה פעם קפוא לילה, מיד להעביר חנקן נוזלי. אמנם לא מתבצעת בחירה שיבוט בפרוטוקול זה, אך ייתכן כי culturing מורחבת עובר מוביל לבחירה טבעית של אוכלוסיית תאים ראשונית עם צמיחה חיובית ושיעור הישרדות. לכן, חשוב לזכור את מספר המעבר ואת הטיפול בעת ביצוע ניסויים. אנו מעדיפים להשתמש במעברים נמוכים יותר לניסויים, אם אפשר, איננו חורגים מהעברת קווי התאים יותר מ-20 פעמים. מאז NPCs לגדול במהירות, מספר גדול של מניות ניתן להקפיא במעברים נמוכים יותר לניסויים. קווי תאים עם שיעורי צמיחה גבוהים במיוחד נמצאים בסיכון גבוה יותר לחומציות מדיה. לכן, ככל שקווי התאים גדלים במהירות שונה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כמות המדיה בהתבסס על התפשטות. אם התאים נשארים ברציפות במדיה חומצית מאוד, זה יכול להשפיע על הבריאות של קווי תאים שליטה ומחלות. זה גורם אפילו אסטרוציטים בריאים להיות תגובתי, המשפיעים על השימוש בהם בידול נוסף וניסויים.

עבור בידול אסטרוציטים, חשוב לשמור על התאים בצפיפות נמוכה כמו צפיפות גבוהה תמנע התאים להבדיל והם ימשיכו להתרבות בקצב גבוה יותר. לכן, צפיפות הזריעה צריכה להיות מותאמת עבור כל קו תאים תלוי בקצב התפשטות שלהם. אנו ממליצים לנסות צפיפויות זריעה שונות ולבצע כתמים /RT-PCR עם סמני אסטרוציטים כדי להבטיח בידול נאות. ניתן להעריך את איכות ה-IAS לצד בקרות בריאות באמצעות מבחני תרבות משותפים עם נוירונים. בתנאי פתולוגיה המחלה אינה מובילה פנוטיפ תגובתי, נוירונים צריכים להישאר קיימא במגע עם iAs במשך כמה ימים. מורפולוגיה אסטרוציטים יכולה להשתנות מאוד בין קווי תאים בודדים ויכולה להיות מושפעת גם מהפנוטיפ של המחלה. יתר על כן, במחלות שבהן אסטרוציטים מושפעים במידה רבה, הם עשויים להראות פנוטיפ תגובתי עם הרחבות גדולות ומוארכות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לכל המטופלים והמתנדבים הבריאים על תרומת דגימות קריטיות למחקרים. יתר על כן, אנו מודים לרושל רודריגו על סיוע טכני מתמשך של מומחים בתרבית רקמות ולורה פראיואולו שאישרה באופן עצמאי את הטכניקה במעבדה שלה כמשתפת פעולה. עבודה זו קיבלה מימון מהמכונים הלאומיים של ארה”ב למענקי בריאות R01 NS644912-4 ו- RC2 NS69476-01 (ל- A.L.S. ) ומרכז פקארד למענק מחקר ALS P2ALS וקרן הקישור המסייע. K.M. גם קיבל מימון מהקרן הלאומית למדע השוויצרי, כמו גם פרס פיתוח החוקר הצעיר מאיגוד ניוון השרירים, קרן המחקר תסמונת רט ומשפחות של קרנות SCN2A.

Materials

100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic Corning 430167 Tissue culture
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene USA Scientific 1475-1611 Used for lifting and centrifuge cells
50mL Conical Centrifuge Tubes USA Scientific 1500-1811 Media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062 Antibiotic with antifungal activity for media preparation
B-27  Supplement (50X), serum free Invitrogen 17504044 For NPC and base media
Cryogenic vials  1.2ML Corning CLS430658-500EA For freezing cell stocks
DMEM, high glucose, GlutaMAX  Supplement, pyruvate Gibco 10569010 For fibroblast and Astrocyte media
DMEM/F-12, GlutaMAX  supplement Gibco 10565042 For NPC and base media
DMSO Sigma D2438-50ML For freezing cell stocks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190136 Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit ALSTEM RF101 Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house.
Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000-036 Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher 14-955-461 Filter media (50mL)
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3149-10KU Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X
Human Plasma Fibronectin Purified Protein Millipore Sigma FC010-10MG Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating.
Isopropanol (technical grade) Fisher Scientific S25372A For freezing cell stocks
Mr. Frosty Thermo Fisher 5100-0001 For freezing cell stocks
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048 For Astrocyte, NPC and base media
Recombinant Human EGF Preprotech AF-100-15 Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots
Recombinant Human FGF-basic Preprotech 100-18B Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs.
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System Millipore Sigma S2GPU05RE Media filtration
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid Fisher 08-772-1B Tissue culture
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Invitrogen 25300062 Lifting of Fibroblasts and Astrocytes
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile Millipore Sigma 80-2502 Filter media (50mL)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leenaars, C. H. C., et al. Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223 (2019).
  2. Rhrissorrakrai, K., et al. Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge. Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).
  3. Hartung, T. Thoughts on limitations of animal models. Parkinsonism & Related Disorders. 14, 81-83 (2008).
  4. Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).
  5. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  6. Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability. PLoS Genetics. 8 (8), 1002913 (2012).
  7. Stricker, S. H., Gotz, M. Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming. Neurobiology of Disease. 148, 105174 (2020).
  8. Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359 (2017).
  9. Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state. Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).
  10. Kim, E., Tae, G. Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate. Biomaterials Research. 20, 39 (2016).
  11. Kim, J., et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).
  12. Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).
  13. Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).
  14. Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. Direct lineage reprogramming to neural cells. Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  16. Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
  17. Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors. Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).
  18. Grath, A., Dai, G. Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Biological Engineering. 13, 14 (2019).
  19. Meyer, K., et al. Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).
  20. Lee, M., et al. Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson’s Disease Patients. International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).
  21. Meyer, K., Kaspar, B. K. Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish. Brain Research. 1656, 27-39 (2017).
  22. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42 (5), 1291-1301 (2014).
  23. Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
  24. Ferraiuolo, L., et al. Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).
  25. Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington’s Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258 (2019).
  26. Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).
  27. Hautbergue, G. M., et al. SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits. Nature Communications. 8, 16063 (2017).
  28. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).
  29. Gatto, N., et al. Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease. Aging Cell. , (2020).
  30. Caiazzo, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors. Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).
  31. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
  32. Pear, W. Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants. Current Protocols in Molecular Biology. , 11 (2001).
  33. Boczonadi, V., et al. Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons. Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).
  34. Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).

Tags

In Vitro ModelingNeurological DiseasesFibroblastsNeuronal Progenitor CellsAstrocytesDirect ConversionSkin BiopsyRetroviral VectorsOct3/4Klf4Sox2C-MycTransductionNeurodegenerative DiseasesCell CultureCo-culturesDisease MechanismsMedication Testing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dennys, C. N., Sierra-Delgado, J. A., Ray, S. S., Hartlaub, A. M., Roussel, F. S., Rodriguez, Y., Meyer, K. In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes. J. Vis. Exp. (172), e62016, doi:10.3791/62016 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image