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CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

Published: December 11, 2020
doi:
10.3791/62001
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,The University of Tulsa

Summary

O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

Abstract

O sistema de proteínas associadas ao Short Palindromic Repeat (CRISPR) /Streptococcus pyogenes CRISPR foi aproveitado por pesquisadores para estudar problemas biologicamente relevantes importantes. O poder incomparável do método de edição do genoma CRISPR/Cas permite que os pesquisadores editem precisamente qualquer lócus de sua escolha, facilitando assim uma maior compreensão da função genética. Vários métodos para edição do genoma C. elegans por CRISPR/Cas9 foram descritos anteriormente. Aqui, discutimos e demonstramos um método que utiliza complexos in vitro montados de ribonucleoproteína e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Especificamente, neste artigo, passamos pelo processo passo-a-passo de introduzir códons de parada prematura no gene C. elegans rbm-3.2 por reparo direcionado à publicação por homologia usando este método de edição CRISPR/Cas9. Este método de edição relativamente simples pode ser usado para estudar a função de qualquer gene de interesse e permite a geração de C. elegans editados homozigos pela edição CRISPR/Cas9 em menos de duas semanas.

Introduction

A tecnologia Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) permite a edição eficiente do genoma direcionado em uma ampla gama de organismos1,2,3,4. O sistema CRISPR foi descoberto pela primeira vez como parte de uma resposta imune antiviral procariótica5,6,7. O sistema CRISPR tipo II usa uma endonuclease como Cas9, um RNA transativante (tracrRNA) e um guia longo de 20 nucleotídeos de 20 nucleotídeos núpcias, específicos do DNA, CRISPR RNA (crRNA) para reconhecer um motivo adjacente “NGG” Protospacer (PAM) e fazer uma quebra duplamente encalhada no DNA alvo5,6,7,8,9,10,11,12. Esta ruptura de dois fios é reconhecida como uma lesão pela máquina de reparação de DNA celular. Consequentemente, a ruptura gerada de dupla-encalhada pode ser reparada por uma das duas vias: i) Junção final não homólogo (NHEJ) ou ii) Reparo direcionado à escoologia (HDR)13. O NHEJ é frequentemente propenso a erros e, portanto, quando este caminho é usado para reparar a quebra dupla-encalhada no DNA alvo, muitas vezes causa mutações inativantes (inserções, exclusões) no gene de interesse. Por outro lado, fornecendo um modelo de reparo exógeno com homologia para ambos os lados da quebra de dois fios, o maquinário de reparação de DNA celular pode ser direcionado para usar HDR para reparar a quebra13. Assim, o método HDR permite a edição precisa de qualquer lócus de interesse.

Uma variedade de protocolos de edição de genes CRISPR/Cas9 foram descritos para C. elegans14,15,16,17,18,19,20. Os métodos de edição CRISPR/Cas9 mais comumente empregados em C. elegans incluem protocolos baseados em clonagem e sem clonagem para gerar modelos de reparo para edição crispr/cas914,15,16,17,18,19,20. Este protocolo discute em detalhes um protocolo de edição CRISPR/Cas9 sem clonagem baseado no uso do dpy-10 como um marcador co-CRISPR para triagem. Até agora, o único protocolo de vídeo de edição CRISPR/Cas9 focado em C. elegans, focado em C. elegans,que existe, utiliza um marcador fluorescente para a triagem21. No entanto, o uso de um marcador fluorescente para triagem requer acesso a um microscópio de fluorescência, que muitos laboratórios de pequenas instituições de graduação (PUIs) podem achar de difícil acesso. É encorajador notar que resultados correlativos positivos foram obtidos em estudos anteriores entre vermes portadores de marcadores fluorescentes e a presença da edição21,22. No entanto, estudos adicionais são necessários para determinar a eficiência global do método de triagem baseado em fluorescência para editar uma grande variedade de loci com diferentes RNAs guia e modelos de reparo. Finalmente, uma vez que os plasmídeos codificados para esses marcadores fluorescentes formam matrizes extracromosomais, a fluorescência variável é frequentemente produzida a partir dessas matrizes que podem dificultar a identificação depositivos 23. Assim, embora o método de triagem baseado em fluorescência possa ser útil para adotar, as questões acima mencionadas podem limitar sua aplicabilidade.

O uso de um marcador co-CRISPR que produz um fenótipo visível reduz consideravelmente o número de descendentes que precisam ser rastreados para encontrar um worm editado positivamente23,24,25,26,27,28. É importante ressaltar que os fenótipos produzidos por esses marcadores podem ser facilmente detectados sob um microscópio de dissecação simples23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. O marcador co-CRISPR dpy-10 é um dos marcadores co-CRISPR mais caracterizados e amplamente utilizados para a realização da edição do genoma C. elegans CRISPR/Cas924,27. Portanto, este artigo discutirá o método de realização da edição CRISPR/Cas9 em C. elegans utilizando a entrega direta de complexos de ribonucleoproteína com dpy-10 como co-CRISPR marcador27,35. Neste método, a mistura de injeção de edição preparada consiste em um modelo de reparo dpy-10 e dpy-10 bem caracterizado para mediar a geração de um fenótipo dominante observável (Rol) que é conferido por uma mutação heterozícula dpy-10(cn64) no gene dpy-10 24,27,29. Quando presente em seu estado homozigoso, a mutação dpy-10(cn64) causa um fenótipo dumpy (Dpy) que produz vermes mais curtos e stouter24,29. O fenótipo Rol é mediado pela inserção precisa do modelo de reparo dpy-10 co-fornecido em uma única cópia do gene dpy-10 pela edição CRISPR/Cas9 mediada pelo HDR. Portanto, o aparecimento de Rol C. elegans indica uma injeção bem sucedida, bem como um evento de edição bem-sucedido mediado por HDR dentro das células do worm injetado. Uma vez que o crRNA e o modelo de reparo do gene de interesse alvo estão na mesma mistura de injeção com o modelo de reparo dpy-10 crRNA e dpy-10, há uma boa chance de que os worms Rol identificados também foram simultaneamente editados no gene alvo de interesse. Assim, esses worms Rol são então selecionados para a edição de interesse por técnicas como reação em cadeia de polimerase (PCR) (para edições superiores a 50 bp) ou por PCR seguido de digestão de restrição (para edições inferiores a 50 bp).

As vantagens de usar este método para edição de genomas são: i) Edições CRISPR podem ser geradas com uma eficiência relativamente alta (2% a 70%) usando este método27; ii) os modelos de reparo e os RNAs que são utilizados neste método não envolvem clonagem, reduzindo assim o tempo necessário para sua geração; iii) por meio da montagem de complexos de ribonucleoproteína in vitro,as concentrações dos complexos de edição montados podem ser mantidas relativamente constantes, melhorando assim a reprodutibilidade; iv) alguns RNAs guiados que não geram edições quando expressas a partir de plasmídeos foram mostrados para trabalhar para a edição do genoma CRISPR/Cas9 quando fornecido como crRNAs transcritos in vitro 27; v) a inclusão do marcador co-CRISPR dpy-10 permite uma triagem fácil usando um microscópio de dissecação e diminui o número de prole que devem ser rastreados para encontrar positivos24,27; e vi) sequenciamento de DNA verificado linhas de vermes homozigosidas podem ser obtidas por este método dentro de um par de semanas19,27.

Excelentes capítulos de livros relativos a muitos métodos diferentes de C. elegans CRISPR foram publicados14,15,16,17,18,19,20,43. No entanto, falta a demonstração do método co-CRISPR dpy-10 em um formato de vídeo em um ambiente de laboratório. Neste artigo, descrevemos e demonstramos o processo de uso do método co-CRISPR dpy-10 para editar um gene-alvo representativo chamado rbm-3.2, uma proteína putativa de ligação de RNA (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  Especificamente, aqui descrevemos em detalhes o método de introdução de três códons de parada prematura dentro do gene C. elegans rbm-3.2 usando complexos de ribonucleoproteína montados in vitro e um modelo de reparo linear de fio único exogenou. Estes estudos foram bem sucedidos na geração da primeira cepa C. elegans CRISPR com códons de parada prematura no gene rbm-3.2. Como não se sabe muito sobre a função deste gene em C. elegans, esta cepa servirá como uma ferramenta útil para dissecar a função de RMB-3.2. Este método também pode ser adotado para fazer inserções, substituições e exclusões em qualquer lócus dentro do genoma C. elegans.

Protocol

Este protocolo para edição de genomas CRISPR/Cas9 foi aprovado pelo Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade de Tulsa seguindo as diretrizes do NIH. Ao longo deste protocolo, foi praticada técnica estéril. Todas as etapas deste protocolo foram realizadas utilizando reagentes livres de nucleases. Foram tomados cuidados especiais para evitar a contaminação do RNase, como luvas de limpeza, bem como espaços de trabalho e equipamentos (por exemplo, pipetas, exterior de vidro, etc.) com uma solução de descontaminação RNase. 1. design crRNA Encontre o PAM que permite que o Cas9 corte mais perto do site de edição. O site da PAM é 5′-NGG-3′. Lembre-se que o PAM pode estar em qualquer fio do DNA. Selecione 20 bp no final de 5′ do PAM como a sequência de crRNA.NOTA: A sequência real de crRNA sintetizada por empresas comerciais é superior a 20 bp, pois possui uma sequência genérica adicional que é automaticamente adicionada à sequência de crRNA específica de 20 bps pela empresa sintetizadora. Em relação aos efeitos fora do alvo, estudos recentes não encontraram efeitos fora do alvo de Cas9 em C. elegans36,37,38,39,40. Além disso, as cepas editadas pelo CRISPR resultantes são outcrossed. Portanto, não estamos muito preocupados com os efeitos fora do alvo dos crRNAs projetados. No entanto, sites online, incluindo http://genome.sfu.ca/crispr/ e http://crispor.tefor.net/ podem ser usados para encontrar e selecionar os crRNAs com os efeitos menos fora do alvo38,41. crRNAs que terminam com um G ou GG e aquelas com maiores de 50% de teor GC são previstas para serem mais eficientes19,23,42. Peça pelo menos 10 nmol do crRNA de uma empresa (por exemplo, IDT, Horizon Discovery, etc.). Uma vez que o crRNA liofilizado chegue, armazene-o a -30°C até o dia da microinjeção. No dia da realização da microinjeção, gire o crRNA liofilizado em velocidade máxima (17.000 x g) por um minuto e resuspense-o em 5 mM Tris-Cl (pH 7.4) para fazer um estoque de 8 μg/μL do crRNA. Armazene o estoque de crRNA nãoutil congelado a -80 °C. 2. Design do modelo de reparo Baixe um software de manipulação de sequência (por exemplo, visualizador de sequência CLC, APE, Snapgene, Vector NTI, etc.). Usamos o visualizador de sequência CLC versão 8.0 (Qiagen) pois é fácil de usar e pode ser baixado gratuitamente. Cole a sequência do DNA alvo de interesse no visualizador da sequência. A orientação do modelo de reparo influencia a eficiência de edição28. Para inserir uma sequência de reparos na extremidade de 5′ do PAM, projete um modelo de reparo de um único fio com sequência de DNA do mesmo fio de DNA em que a sequência PAM está localizada (protoespaçor)28. Enquanto para inserir uma sequência de reparos na extremidade de 3′ do PAM, projete um modelo de reparo de um único fio com sequência de DNA do fio de DNA que não carrega a sequência PAM (fio espaçador)28. Selecione 35 pares de base de sequência com homologia ininterrupta em ambos os lados (na extremidade de 5′ e 3′) da edição. Mutar ou excluir o PAM para evitar o corte do modelo de reparo ou do DNA genômico editado pelo Cas9. Se a mutação do PAM não for possível, introduza várias mutações silenciosas perto da extremidade de 5′ do PAM para evitar o corte do modelo de reparo ou do DNA genômico editado. Certifique-se de introduzir apenas mutações silenciosas do PAM se ele estiver presente em uma região exônica. Verifique a frequência de uso do codon para garantir que o códon mutado seja introduzido em uma frequência comparável ao códon original não mutado (por exemplo, https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). Em alguns casos, pode não ser possível introduzir o códon mutado em uma frequência semelhante ao códon nãomutado. No entanto, para fazer mutações de alguns aminoácidos, não esperamos que o nível de expressão da proteína mutante seja alterado significativamente. Se a edição for pequena (por exemplo, mutação de algumas bases), introduza um site de restrição exclusivo perto da edição por mutagenese silenciosa. Usamos http://heimanlab.com/cut2.html para encontrar locais de restrição que podem ser introduzidos por mutagênese silenciosa. Verifique a frequência de uso do codon para garantir que o códon mutado seja introduzido em uma frequência comparável ao códon original não mutado. Como dito acima, isso nem sempre é possível. No entanto, para experimentos envolvendo mutações de alguns aminoácidos, não esperamos que o nível de expressão da proteína mutante seja alterado significativamente. Sintetizar e comprar modelos lineares de reparo mono-encalhados para HDR como oligos ultramer de 4 nmol. Resuspenja o modelo de reparo de oligonucleotídeos liofilizados em água sem nuclease para fazer um estoque de 1 μg/μL do modelo de reparo e armazená-lo a -30 °C até uso adicional. 3. Projeção de projeto de primer Usando o visualizador de sequência CLC ou outras aplicações similares, projete 20 a 23 primers de base para frente e primers invertidos em ambos os lados da edição, respectivamente, de modo que eles produzam uma banda entre 400 e 600 pares de base após a amplificação do PCR. Para inserções maiores que são várias quilobases de tamanho, projete o primer dianteiro para estar localizado fora do braço de ecologia esquerda do modelo de reparo. Projete o primer reverso a ser localizado dentro do próprio modelo de reparo. Neste caso, um produto PCR só será obtido no caso de worms editados positivamente. Para identificar vermes editados homozigos para inserções mais longas, amplie toda a região da inserção projetando primers dianteiros e invertidos que estão localizados fora das junções de inserção. Teste os primers e otimize as condições de PCR com DNA genômico do tipo selvagem antes de usar os primers para genotipagem. Certifique-se de que uma única faixa de tamanho esperado seja produzida após a amplificação do DNA genômico do PCR (quando aplicável). 4. Preparando vermes adultos jovens para injeção Escolha L2-L3 estágio C. elegans em um gramado bacteriano fresco em uma placa MYOB e incubar a 20 °C durante a noite.NOTA: O protocolo para fazer placas MYOB pode ser encontrado aqui: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/ No dia da microinjeção, escolha vermes adultos jovens com menos de 10 embriões no útero para injetar. 5. Preparando a mistura de injeção Prepare a mistura de injeção na mesma ordem mostrada na Tabela 1 em tubos livres de nuclease estéreis.NOTA: Os componentes da mistura de injeção podem ser reduzidos para baixo para fazer misturas de injeção de 5 μL (em vez de 20 μL) se futuras injeções com esta mistura não forem previstas. Misture a mistura de injeção por pipeta. Incubar a mistura de injeção a 37 °C por 15 minutos para montar complexos de ribonucleoproteína. Gire a mistura de injeção a 4 °C a 17.000 x g por 5 minutos. 6. Microinjeção na gônus C. elegans Realize a microinjeção da mistura de injeção CRISPR no C. elegans gonad, conforme descrito em Iyer et al. 201943. Injete cerca de 30 vermes com mistura de injeção CRISPR. A mistura de injeção não utilizada pode ser reutilizada armazenando a 4°C por um período de cerca de 6 meses sem perda de eficiência49. Injete os dois braços de gônda, se possível. Vermes injetados são considerados a geração P0. 7. Recuperação e transferência de vermes injetados Após a microinjeção, mova os vermes P0 microinjetados usando uma picareta de worm para uma placa de ágar MYOB de 60 mm semeada com OP50 E. coli e deixe-os se recuperar em temperatura ambiente por cerca de uma hora. Note que a temperatura de recuperação dependerá do genótipo dos vermes injetados. Por exemplo, para cepas sensíveis à temperatura, a recuperação de vermes a uma temperatura diferente pode ser necessária. Usando uma picareta de fio de platina, transfira cada verme injetado em uma única placa de petri de ágar myob de 35 mm semeada e deixe-os colocar ovos a 20 °C até o dia seguinte. Note que alguns vermes morrerão como resultado de ferimentos do procedimento de microinjeção. Só escolha os vermes que estão vivos e exemee o movimento. Após 24 horas, transfira os vermes injetados para novas placas individuais (1 verme por placa). 8. Escolhendo C. elegans para triagem 3 a 4 dias a 20°C após a injeção ser realizada, monitore todas as placas que contenham a prole dos vermes injetados usando um microscópio dissecando. Identifique placas que tenham fenótipos de f1 progeny (Rol) e dumpy (Dpy). Um fenótipo dpy é onde os vermes aparecem mais curtos e mais baixos do que os worms de controle no mesmo estágio de desenvolvimento (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0–10). Placas com vermes Rol e Dpy representam placas onde a prole F1 foi editada com sucesso com a mutação dpy-10(cn64) para estar presente em seu estado heterozigoso ou homozigoso, respectivamente. Escolha as placas com mais vermes de rolo e lixo para triagem. Despreite 50 a 100 vermes F1 Rol dessas placas para suas próprias placas individuais (1 verme por placa) e permita que eles coloquem ovos. Permita que os vermes F1 Rol, encenados em L4, coloquem ovos e produzam prole (F2) por 1 a 2 dias. 9. Lise de verme único e PCR Depois de produzir F2 por 1 a 2 dias, transfira cada mãe F1 Rol individual em 2,5 μL de tampão de lise (Tabela 2) com uma diluição de 1:100 de 20 mg/mL Proteinase K. Congele os tubos a -30 °C por 20 minutos. Os vermes podem ser armazenados nesta fase por um período prolongado até uma análise mais aprofundada. Realize uma única lise de verme em um termociclador PCR com as seguintes condições: 60 °C durante 1 hora, 95 °C por 15 min e mantenha a 4 °C. Adicione os seguintes reagentes diretamente a 2,5 μL do worm lysed contendo tubo PCR: 12,5 μL de mistura PCR 2x contendo dNTPs, Polimerase de DNA, MgCl2 e corante de carregamento, 1 μL de primer dianteiro de 10 μM, 1 μL de primer reverso de 10 μM e água estéril a 22,5 μL. O volume total de cada reação pcr é de 25 μL.NOTA: No caso de triagem de vários worms F1, é mais rápido e conveniente fazer um mix mestre pcr para múltiplas reações e adicionar 22,5 μL da mistura mestre a cada tubo de lise. Configure reações pcr em um termociclador com as seguintes condições: 95 °C por 1 minuto, 35 ciclos de 95 °C para 15 s, 55 °C para 15 s (otimizar para cada conjunto de primer), 72 °C por 1 minuto (otimizar para cada DNA alvo)44. Segure as reações a 4 °C. 10. Digestão de restrição e eletroforese de gel agarose NOTA: Uma digestão de restrição só é necessária durante a triagem para pequenas edições (menos de 50 bp). Transfira 10 μL do DNA PCR da etapa 9 para um novo tubo. Adicione entre 2 a 4 unidades de enzima de restrição e tampão de enzima de restrição de 1x (1,5 μL de tampão de reação de 10x) por reação de 15 μL. Incubar a 37 °C (ou em outras temperaturas específicas da enzima) por 2 horas (tempos de incubação mais curtos podem ser possíveis com enzimas de ação rápida). O calor inativa a digestão da restrição aquecendo os tubos PCR a 65 °C (ou outra temperatura específica da enzima) por 10 a 15 minutos. Carregue toda a reação de cada tubo PCR em um único poço de gel de 1%-2% de agarose e execute gel a 110 mA até que a separação adequada da banda seja alcançada.NOTA: Usamos uma mistura pcr que já tem um corante de carregamento incluído para visualização durante a execução em um gel de agarose. Esta mistura não interfere na reação de digestão de restrição e, portanto, é conveniente de usar para triagem de muitos vermes ao mesmo tempo. 11. Identifique worms editados positivamente Visualize géis de agarose sob luz UV (para géis de brometo de ethidium) para detectar tamanhos de banda de DNA.NOTA: Os worms editados positivamente exibirão uma faixa extra de DNA no tamanho esperado devido à edição usando o modelo de reparo que carrega o local de restrição no lócus desejado dentro do genoma do worm. Espera-se que os worms de rolo F1 sejam heterozigos para a edição e, portanto, espera-se que exa apresentem três bandas (um produto PCR não cortado do tipo selvagem e dois fragmentos menores do produto PCR de corte editado). Embora raro, deve-se notar que os homozigotes surgem ocasionalmente. Salve todas as placas originais editadas positivamente até que a presença da edição seja verificada pelo sequenciamento Sanger. 12. Edição homozygose de interesse Escolha entre 8 e 12 vermes F2 de aparência selvagem não-rolante a partir das respectivas placas de verme f1 Rol editadas positivamente e permita que eles coloquem ovos e produzam prole por 1 a 2 dias.NOTA: Uma vez que C. elegans são hermafroditas auto-fertilizantes, se o alelo editado não afetar viabilidade ou desenvolvimento, a proporção de mutantes homozigos esperados deve ser de aproximadamente 25%. Vermes F2 não rolamentos devem ser do tipo selvagem para o lócus dpy-10. A escolha de worms não-rolamentos permite a geração de worms editados que perderam a mutação dpy-10(cn64) e só têm a mutação em seu gene de interesse. Note que o gene dpy-10 está presente no cromossomo II. Se o seu gene de interesse estiver ligado ao DPY-10,você pode não ser capaz de segregar facilmente a mutação dpy-10 longe do seu gene de interesse. Realize as etapas 9 a 11 para identificar linhas de vermes homozigos. 13. Confirmar a edição por sequenciamento Uma vez identificados vermes homozigos, realize a lise e o PCR conforme descrito na etapa 9. Configure pelo menos 3 reações pcr para cada linha homozygous a ser sequenciada. Purifique as reações do PCR usando um kit de purificação pcr. Meça a concentração de DNA usando um espectotômetro nanodrop. Envie a amostra com o respectivo primer para frente para sequenciamento de Sanger. Certifique-se de que o primer dianteiro foi projetado para estar a pelo menos 50 bases de distância da edição a ser sequenciada. Analise os resultados de sequenciamento usando software de análise de sequência para confirmar a presença da edição.

Representative Results

rbm-3.2 é uma proteína putativa de ligação de RNA que tem homologia para a subunit 2 tau do fator de estimulação do decote humano (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). A proteína RBM-3.2 foi identificada como parceira vinculante da Proteína Fosfattase 1 (GSP-1) e seus reguladores Inibidor-2 (I-2SZY-2) e SDS-22 em um estudo anterior que identificou essas proteínas como novos reguladores da duplicação centriola C. elegans (dados não apresentados)45. Atualmente, muito pouco se sabe sobre a função do gene rbm-3.2 em C. elegans. Assim, para investigar melhor o papel biológico do gene C. elegans rbm-3.2, o alo rbm-3.2-alelo nulo rbm-3.2(ok688) foi obtido do Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC). Infelizmente, além de possuir uma exclusão de todo o gene rbm-3.2, o alelo rbm-3.2 (ok688) também resulta em uma exclusão parcial de um gene sobreposto, rbm-3.1, complicando assim a análise genética. Portanto, para investigar com precisão o papel do gene rbm-3.2 em C. elegans, usamos a edição CRISPR/Cas9 para introduzir três codons de parada prematura muito perto do início da região de codificação C. elegans rbm-3.2, deixando o gene rbm-3.1 sobreposto intacto. Para introduzir esses códons de parada prematuros no gene C. elegans rbm-3.2, projetamos um crRNA com um motivo PAM que estava localizado na cadeia oposta (fio de modelo) do DNA (Figura 1A). O local do corte Cas9 estava localizado a 6 bases do códon inicial RBM-3.2 ATG. Para introduzir códons de parada prematura no gene rbm-3.2, projetamos um modelo de reparo com as seguintes cinco características principais: 1) 35 bases de homologia ininterrupta para o cócmento rbm-3.2 a montante do codon de partida rbm-3.2 (braço de escoriação esquerda) 2) A curto trecho de bases contendo o motivo PAM foi excluído 3) Um site de restrição EcoRI foi introduzido imediatamente após o codon inicial para a triagem 4) O segundo e o terceiro codons do rbm-3.2 foram excluídos e três códons de stop foram introduzidos após o quinto códon RBM-3.2 para parar a tradução do rbm-3.2 mRNA 5) 35 bases de homologia ininterrupta ao primeiro intron do rbm-3.2 foram incluídas a jusante da edição (braço de ecologia direita) ( Figura1B). A mistura de injeção para este experimento CRISPR foi preparada como indicado na Tabela I. A mistura de injeção foi incubada a 37 °C por 15 minutos para montar complexos de ribonucleoproteína. A mistura foi então centrifugada e carregada na agulha de microinjeção puxada. A microinjeção na gônnad de C. eleganfoi realizada conforme descrito em Iyer et al. 201943. A Figura 2 retrata a linha do tempo experimental para gerar C. elegans editados usando este protocolo. Embora normalmente injetemos 30 worms para cada experimento CRISPR, alguns laboratórios injetam menos vermes (entre 10 a 20) para cada experimento CRISPR. Uma vez que injetar mais worms aumenta a probabilidade de encontrar edições positivas, preferimos injetar um número maior de worms. Muitos laboratórios escolhem ninhadas “jackpot” (placas com mais de 50% de Rol e Prígeno dpy) para triagem. Em nossa experiência depois de realizar vários experimentos CRISPR, embora as ninhadas de jackpot surjam ocasionalmente, na maioria das vezes, os worms Rol que são escolhidos para a triagem muitas vezes vêm de muitas placas P0 diferentes, cada uma consistindo de algumas prole rol. Nenhuma ninhada jackpot foi obtida neste experimento. No total, examinamos o DNA genômico de 73 worms F1 Rol que foram obtidos de 7 worms P0 injetados para a presença da edição. As sequências dos primers de triagem e suas localizações em relação ao códon inicial do gene rbm-3.2 estão representadas na Figura 3A. Através de nossa análise, 7 dos 73 vermes F1 foram considerados positivos para a edição (9,5%) ( Figura3B). Vermes não identificados exibiram um único fragmento de DNA de 445 bp após a digestão EcoRI. Considerando que os vermes portadores de um códon de parada prematura no gene rbm-3.2 apresentaram dois fragmentos de 265 bp e 166 bp, respectivamente, após a digestão EcoRI. Vermes heterozigos apresentados exibiram três fragmentos após a digestão ecori: um fragmento de DNA não editado do tipo selvagem de 445 bp e dois fragmentos de DNA de 265 bp e 166 bp, respectivamente, a partir da cópia editada do gene rbm-3.2. Para identificar vermes carregando edições homozigas, transferimos 12 vermes F2 dos heterozygotes F1 positivos identificados para novas placas individuais e permitimos que produzissem progêneres (F3). Os vermes F2 foram então examinados para a homozigosidade, como descrito anteriormente. 6 de 12 (50%) vermes selecionados foram considerados homozigos para nossa edição de interesse (Figura 4A). O DNA genômico de uma linha de vermes homozygous identificada foi usado para configurar uma reação de sequenciamento de DNA. A análise de sequenciamento de DNA confirmou a presença da edição em seu estado homozigoso (Figura 4B). Em geral, é benéfico sequenciar múltiplas linhas de vermes homozigos para garantir que todas as linhas de vermes editadas por homozigos apresentem o mesmo fenótipo (se a mutação nula produzir um fenótipo específico). Além disso, também pode ser necessário validar nocautes genéticos usando um ensaio baseado em expressão, como mancha ocidental ou RT-PCR ou através de análise de fenótipo. Isso porque, é possível que, apesar de introduzir códons de parada prematura no início do gene, um ATG alternativo possa estar presente a jusante dos códons de parada prematura. Este ATG poderia ser usado para iniciar a expressão proteica, resultando em uma proteína truncada parcialmente funcional. Reagente Concentração Volume para Adicionar Proteína Cas9 em água sem nuclease com 20% de glicerol 2 μg/μL 5 μL tracrRNA em 5 mM Tris-Cl pH 7.5 4 μg/μL 5 μL dpy-10 crRNA em 5 mM Tris-Cl pH 7.5 8 μg/μL 0,4 μL rbm-3.2 crRNA em 5 mM Tris-Cl pH 7.5 8 μg/μL 1 μL dpy-10 modelo de reparo em água estéril sem nuclease 500 ng/μL 0,55 μL rbm-3.2 modelo de reparo em água estéril sem nuclease 1 μg/μL 2,2 μL KCl em água estéril sem nuclease 1 M 0,5 μL água estéril sem nuclease – 5,35 μL Tabela 1: Componentes da mistura de injeção para edição CRISPR/Cas9 usando complexos de ribonucleoproteína e dpy-10 como marcador co-CRISPR. Use técnicas estéreis e reagentes sem RNase enquanto faz a mistura de injeção. Observe que a água estéril e não-DEPC tratada sem nuclease foi usada para fazer a mistura de injeção. Reagente Concentração Volume para adicionar Kcl 1 M 5 mL Tris-HCl pH 8.3 1 M 1 mL MgCl2 1 M 250 μL NP-40 (ou IGEPAL CA-630) 100% 450 μL Tween-20 100% 450 μL Gelatina 2% 500 μL Água – 92,35 mL Tabela 2: Receita tampão de lise de verme. O tampão de lise de verme pode ser feito a granel, autoclaved, filtrado e aliquoted para armazenamento a longo prazo (NOTA: o tampão de lise pode ser armazenado por mais de um ano à temperatura ambiente). Adicione uma diluição de 1:100 de 20 mg/mL proteinase K ao tampão de lise de verme pouco antes de cada uso. Figura 1: Esquemático mostrando crRNA e design de modelo de reparo para rbm-3.2 parada prematura CRISPR. A. Esquema exibindo os fios de codificação e modelo do gene rbm-3.2 com a sequência de crRNA e a sequência de motivos PAM localizada no fio do modelo. B. Esquema representando as diferentes características do modelo de reparo que foi sintetizado para introduzir três códons de parada prematura no gene rbm-3.2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Cronograma experimental para gerar C. elegans editados homozigos pela edição CRISPR/Cas9 usando complexos de ribonucleoproteína pré-remontados e dpy-10 como marcador co-CRISPR. Uma análise diária das etapas que precisam ser executadas para gerar C. elegans editados homozigos usando este método de edição CRISPR/Cas9. Resumidamente, 30 worms foram injetados com a mistura de edição CRISPR usando microinjeção e segregados em placas MYOB individuais semeadas com OP50 E. coli. Após 24 horas, os vermes P0 injetados foram transferidos para novas placas myob e autorizados a continuar colocando ovos. Nos dias 3 e 4, após microinjeção, as placas foram examinadas para a presença de vermes Rol F1. As placas com o número máximo de vermes Rol e Dpy F1 foram selecionadas e 73 worms F1 Rol (geralmente escolhemos entre 50 a 100 vermes F1 Rol por experimento CRISPR) foram escolhidos em novas placas myob individuais (1 verme por placa) e autorizados a colocar ovos por cerca de 2 dias. No dia 6, após a microinjeção, os linfonatos de vermes foram preparados a partir dos vermes F1 que haviam produzido progênero (F2) e foram examinados para a presença da edição pelo PCR seguido de digestão de restrição com EcoRI e eletroforese de gel agarose. No dia 7, 12 vermes não-Rol, não Dpy F2 foram transferidos das placas positivas para novas placas individuais e autorizados a produzir prole (F3). No dia 9, os vermes F2 foram examinados para a homozigosidade da edição, como descrito anteriormente. No dia 10, foram realizadas limpeza de vermes, PCR e PCR para os vermes homozigos F3 e a concentração de DNA foi medida por meio de um espectotómetro NanoDrop. No dia 11, reações de sequenciamento de Sanger foram criadas para amostras positivas e as reações foram enviadas para sequenciamento de DNA. No dia 12, os resultados de sequenciamento foram analisados, e a presença da edição foi verificada por meio de um software de análise de sequência (por exemplo, visualizador de sequência CLC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Triagem para C. elegans que são heterozigosos para os códons de parada prematura rbm-3.2. Imagens de eletroforese de gel agarose de C. elegans genômico PCR DNA digerido com EcoRI. 73 worms F1 individuais foram genótipados e selecionados para a presença da edição rbm-3.2. Números vermelhos e asteriscos indicam vermes editados positivamente. Todos os 7 C. elegans identificados positivamente editados foram heterozigos para a edição, pois exibiram um fragmento de DNA não editado de 445 bp e dois fragmentos de DNA de 265 bp e 166 bp, respectivamente, a partir da cópia editada do gene rbm-3.2 após a digestão EcoRI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Identificar e verificar C. elegans editados homozigos carregando os códons de parada prematuro rbm-3.2. A. Triagem para C. elegans que são homozigos para os códons de parada prematura rbm-3.2 . Imagens de eletroforese de gel agarose de C. elegans DNA genômico digerido com EcoRI. 12 worms F2 individuais de placas positivas foram genótipados e examinados para homozigosidade da edição rbm-3.2. Vermelho: vermes editados homozigos. 6 dos 12 vermes F2 (50%) foram homozigos para os códons de parada prematuro rbm-3.2. Nenhum produto PCR estava presente para o worm 7. B. Confirmando a inserção dos códons de parada prematura em rbm-3.2 por sequenciamento de DNA. Esquema mostrando a comparação de DNA e sequências proteicas de homozygotes não editados e editados. A análise dos resultados de sequenciamento de DNA do DNA genômico de vermes editados homozigos confirmou a presença dos três códons de parada prematuros no gene rbm-3.2 após a edição CRISPR/Cas9. Todas as alterações de aminoácidos resultantes após a edição do CRISPR/Cas9 são indicadas em letras vermelhas ou asteriscos vermelhos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Usamos o protocolo acima para editar vários genes além do RBM-3.2. Nossas eficiências de edição para diferentes loci, guiar RNAs e modelos de reparo (single-stranded e double-stranded) variaram entre 2% e 58% (dados não mostrados). As eficiências de edição observadas são comparáveis às eficiências de edição relatadas anteriormente de 2% a 70% para este protocolo27. Também tivemos sucesso em usar essa técnica na realização de eliminações genéticas. Usando dois crRNAs substituímos um gene que tem quase 6 kb de comprimento com a sequência de codificação para proteína fluorescente verde (GFP) (dados não mostrados). Para este experimento, cerca de 14% dos worms Rol F1 analisados foram considerados positivos para a exclusão genética e substituição por GFP (dados não mostrados). No entanto, experimentos adicionais são necessários para determinar o comprimento máximo de exclusões genéticas e substituições que podem ser realizadas usando essa técnica.

Esta técnica pode ser usada para fazer inserções que têm cerca de 1,6 kb de comprimento19. Um estudo recente mostrou que para fazer inserções com mais de 1,6 kb de comprimento usando este protocolo, gerar duas quebras de dois fios e usar modelos de reparo com braços de ecologia mais longos pode permitir a inserção de fragmentos muito maiores de DNA (~10 Kb)28. Alternativamente, várias rodadas de edição de genes com este protocolo podem ser realizadas para gerar edições maiores. Outros protocolos de edição de genes C. elegans CRISPR/Cas9 baseados em plasmídeos também podem ser adotados para experimentos CRISPR envolvendo a inserção de fragmentos de DNA maiores que 1,6 kb46,47,48.

Antes de usar este protocolo para edição de genes, é necessário garantir que o gene de interesse não esteja ligado ao lócus dpy-10 no cromossomo II. No caso de um gene alvo estar ligado ao DPY-10,pode ser problemático separar a mutação dpy-10 longe de sua edição de interesse. Portanto, no caso de o gene de interesse estar ligado ao lócus dpy-10, outros marcadores co-CRISPR como unc-58 (X-cromossomo),unc-22 ou zen-4 (cromossomo IV)e ben-1 ou pha-1 (cromossomo III) que estão localizados em diferentes cromossomos podem ser usados24,25,26,28. Dados do laboratório Meyer demonstram que mutações ben-1 e zen-4 podem ser usadas como marcadores co-CRISPR bem sucedidos para triagem com este método28. No entanto, é importante notar que o uso de zen-4 e pha-1 como marcadores co-CRISPR requer a realização do experimento CRISPR em fundos zen-4(cle10ts) ou pha-1(e2123ts),respectivamente 26, 28. Além disso, experimentos CRISPR envolvendo alguns marcadores co-CRISPR, como o ben-1, podem exigir a preparação de placas especiais (por exemplo, placas contendo benzimidazol)28. Usamos com sucesso o marcador unc-58 co-CRISPR para testar edições positivas para um gene que está ligado ao dpy-10 usando este método (dados não mostrados). A mutação unc-58(e665) confere um fenótipo visível (paralisia) que pode ser efetivamente usado para tela para vermes editados positivamente24. Alternativamente, se o acesso a um microscópio fluorescente estiver disponível, um gene gtbp-1 com marca fluorescente também pode ser usado como um marcador co-CRISPR para este protocolo19.

Para uma alta eficiência de edição ao usar este método de edição de genomas, o site de edição deve estar dentro de 10 a 30 bases do site de corte Cas9. Se o site de edição estiver a mais de 30 bases do site de corte Cas9, a eficiência de edição cai drasticamente19,35,37. No entanto, um estudo recente do laboratório Meyer demonstrou que criar duas quebras de dois fios a uma distância uma da outra pode permitir a inserção de edições longe do site de corte Cas9 usando este protocolo28.

No protocolo atual, o modelo de reparo foi projetado para que todos os três códons stop inseridos apareçam no mesmo quadro de leitura. No entanto, uma estratégia alternativa para criar mutantes nulos seria usar um STOP-IN longo de 43 bases que foi descrito anteriormente50. É importante ressaltar que este tem códons parando em todos os três quadros de leitura possíveis e causa mutações de mudança de quadro. Esta é uma estratégia especialmente útil para gerar mutantes nulos quando ocorre reparo inadequado ou incompleto no site de edição.

Em conclusão, devido à sua curta duração e aos recentes avanços neste método, este é um excelente método para experimentos laboratoriais de rotina envolvendo a adição de tags de epítope imunogênica curta, tags fluorescentes, fazendo supressões genéticas, substituições genéticas e substituições de codon.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por fundos de start-up da Universidade de Tulsa (TU) e pela Tu Faculty Development Summer Fellowship concedida a Jyoti Iyer. Gostaríamos de agradecer ao Programa de Pesquisa de Graduação em Verão de Química (CSURP) e ao Tulsa Graduate Research Challenge (TURC) pela concessão de bolsas aos alunos envolvidos neste estudo. Gostaríamos de reconhecer a Srta. Caroline Dunn por sua assistência técnica. Por fim, gostaríamos de agradecer aos Drs. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter e Saili Moghe por seus comentários críticos sobre este manuscrito.

Materials

Barcoded DNA sequencing tubes Eurofins Genomics SimpleSeq Kit Premixed N/A
Cas9 protein PNA Bio CP01 Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs Horizon Discovery/ GE Dharmacon N/A Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
ECoRI New England Biolabs R3101S Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit Qiagen 28004 Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix Meridian Bioscience BIO-25043 Stored at -30 °C
Primers IDT N/A Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K Gold Bio P-480-SL4 Stored at -30 °C
Repair template oligos IDT N/A 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA Horizon Discovery/ GE Dharmacon U-002005-50 Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
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Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).
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