CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

CRISPR/Cas9ゲノム編集のためのこのプロトコルは、NIHガイドラインに従ってタルサ大学機関バイオセーフティ委員会によって承認されました。このプロトコルを通して、無菌技術が実践された。このプロトコルのすべてのステップは、ヌクレアーゼを含まない試薬を用いて行った。洗浄手袋、作業スペース、機器(ピペット、ガラス製品の外装など)などのRNase汚染を防止するために、RNase除染液を使用して特別な注意を払いました。 1. crRNA設計 編集サイトに最も近い Cas9 を切り取る PAM を見つけます。 PAMサイトは5′-NGG-3’です。 PAMはDNAのどちらの鎖にも含まれる可能性があることを覚えておいてください。 CRRNA配列としてPAMの5’末端に20 bpを選択します。注: 商業企業によって合成される実際の crRNA 配列は、合成会社によって標的特異的な 20 bp crRNA 配列に自動的に付加される追加の一般配列を有するので 20 bp より長い。オフターゲット効果に関しては、最近の研究では、C.エレガンス36、37、38、39、40のCas9のオフターゲット効果は見つかっていません。さらに、結果として生じるCRISPR編集株は交差している。したがって、設計されたcrRNAのオフターゲット効果についてはあまり心配していません。しかし、http://genome.sfu.ca/crispr/ や http://crispor.tefor.net/ を含むオンラインウェブサイトを使用して、ターゲットの効果が最も少ないcrRNAを38、41で検索して選択することができます。GまたはGGで終わり、GC含有量が50%を超えるcrRNAは、より効率的な19、23、42であると予測されています。 crRNAの少なくとも10 nmolを会社から注文する(例えばIDT、ホライズン・ディスカバリー、等)。 凍結乾燥したcrRNAが到着したら、マイクロインジェクションの日まで-30°Cで保管してください。 マイクロインジェクションを行った日に、凍結乾燥したcrRNAを最高速度(17,000 x g)で1分間回転させ、5 mM Tris-Cl(pH 7.4)で再懸濁してcrRNAの8 μG/μLストックを作ります。 未使用のcrRNAストックを-80°Cで冷凍保存してください。 2. 修復テンプレートの設計 シーケンス操作ソフトウェア(例えば、CLCシーケンスビューア、APE、スナップ遺伝子、ベクトルNTIなど)をダウンロードします。CLCシーケンスビューアバージョン8.0(Qiagen)はユーザーフレンドリーで無料でダウンロードできます。 目的のターゲットDNAの配列を配列ビューアに貼り付けます。 修復テンプレートの向きは、編集効率28に影響を与えます。PAMの5’末端に修復配列を挿入するために、PAM配列が配置されているのと同じDNA鎖(プロトスペンサー鎖)28からのDNA配列を持つ一本鎖修復テンプレートを設計する。PAMの3’末端に修復配列を挿入する間、PAM配列(スペーサー鎖)28を運ばないDNA鎖からのDNA配列を持つ一本鎖修復テンプレートを設計する。 編集の両側(5’と3’の終わり)に中断されていない相同性を持つシーケンスの35塩基対を選択します。 修復テンプレートまたは編集されたゲノム DNA を Cas9 で切断しないように PAM を変更または削除します。 PAMの突然変異が不可能な場合は、PAMの5’末端に近いいくつかの無静な突然変異を導入して、修復テンプレートまたは編集されたゲノムDNAの切断を防ぎます。 パムの静かな変異がエキコニック領域に存在する場合にのみ、この PAM の変異を導入するようにしてください。 コドンの使用頻度をチェックして、突然変異したコドンが元の非突然変異コドンに匹敵する頻度で導入されていることを確認してください(例 https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table)。場合によっては、変異したコドンを変異させたコドンと同様の頻度で導入することができない場合がある。しかし、いくつかのアミノ酸の変異を作るためには、変異タンパク質の発現量が大きく変化するとは考えていない。 編集が小さい場合(例えば、数塩基の突然変異)、サイレント突然変異によって編集に近いユニークな制限部位を導入する。http://heimanlab.com/cut2.html を使用して、サイレント突然変異誘発によって導入できる制限部位を見つけます。 コドンの使用頻度を確認して、突然変異したコドンが元の非突然変異コドンに匹敵する頻度で導入されていることを確認します。前述のように、これは常に可能であるとは限りません。しかし、数個のアミノ酸の変異を含む実験では、変異タンパク質の発現量が大きく変化するとは考えていない。 4 nmolウルトラマーオリゴとしてHDRのための線形一本鎖修理テンプレートを合成し、購入。 凍結乾燥したオリゴヌクレオチド修復テンプレートをヌクレアーゼフリー水中に再中断し、修復テンプレートの1 μg/μLストックを作り、さらに使用するまで-30°Cで保存します。 3. プライマー設計のスクリーニング CLC配列ビューアまたは他の類似のアプリケーションを使用して、それぞれ編集の両側に20〜23のベースペアフォワードとリバースプライマーを設計し、PCR増幅時に400〜600塩基対の間のバンドを生成するようにします。 数キロベースの大きな挿入の場合は、修復テンプレートの左相同性アームのすぐ外側に配置されるフォワードプライマーを設計します。修復テンプレート自体内に配置されるリバースプライマーを設計します。この場合、正に編集されたワームの場合にのみPCR産物が得られます。 長い挿入のためにホモ接合性の編集されたワームを識別するには、挿入接合部の外側に配置されている前方および逆プライマーを設計することによって、挿入の領域全体を増幅します。 遺伝子型入力用プライマーを使用する前に、プライマーをテストし、野生型ゲノム DNA で PCR 条件を最適化します。 ゲノムDNAのPCR増幅時に、期待サイズの単一バンドが生成されることを確認します(該当する場合)。 4. 若い成人虫の注射の準備 L2-L3ステージ C.エレガンスを MYOBプレートの新鮮な細菌の芝生に選び、一晩で20°Cでインキュベートします。注: MYOB プレートを作るためのプロトコルは、ここで見つけることができます: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/ マイクロインジェクションの日に、注入する子宮内の胚が10未満の若い成虫を選ぶ。 5. 注入ミックスの準備 滅菌ヌクレアーゼフリーチューブで 表1 に示したのと同じ順序で注入ミックスを準備します。注:このミックスで将来の注入が予想されない場合、注入ミックスの成分をスケールダウンして5 μLインジェクションミックス(20 μLではなく)を行うことができます。 ピペットで注入ミックスを混ぜます。 37°Cで15分間インキュベートし、リボヌクレオプロテイン複合体を組み立てます。 17,000 x g で 4 °C で 5 分間、注入ミックスを回転させます。 6. C.エレガンス 生殖腺へのマイクロインジェクション 2019年43日に記載されているように、C.エレガンス生殖腺へのCRISPR注入ミックスのマイクロインジェクションを行う。 CRISPR注射ミックスで約30ワームを注入します。未使用の注入ミックスは、効率49を失うことなく、約6ヶ月の期間の4°Cで保存することによって再利用することができます。 可能であれば、両方の生殖腺の腕を注入します。注入されたワームはP0 世代と考えられる。 7. 注入されたワームの回復と転送 マイクロインジェクション後、ワームピックを使用してマイクロインジェクションP0 ワームをOP50 大腸菌 で播種した60mmMYOB寒天プレートに移動させ、室温で約1時間回復させます。 回復温度は、注入されたワームの遺伝子型に依存するに注意してください。例えば、温度感受性株の場合、異なる温度でのワーム回復が必要な場合がある。 白金ワイヤーワームピックを使用して、注入された各ワームを単一の播種35mmMYOB寒天ペトリプレートに移し、翌日まで20°Cで卵を産まできるようにする。 一部のワームは、マイクロインジェクション手順による傷害の結果として死ぬことに注意してください。生きているワームだけを選び、動きを示してください。 24時間後、注射されたワームを新しい個々のプレート(プレートあたり1ワーム)に移します。 8. Cを選ぶ.スクリーニングのためのエレガンス 注射を行った後、20°Cで3〜4日、解剖顕微鏡を使用して注入されたワームの子孫を含むすべてのプレートを監視します。 F1 前立腺展示ローラー(Rol)とダンプリー(Dpy)の現象を持つプレートを特定します。Dpy表現型は、同じ発達段階でワームを制御するよりも短く、頑丈に見える場所です(WormBase:https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0–10)。RolとDpyワームを持つプレートは、F1 子孫が、それぞれ異種性またはホモ接合状態で存在する dpy-10(cn64)突然変異 で正常に編集されたプレートを表します。 スクリーニングのための最もローラーとダンプワームとプレートを選びます。 これらのプレートから自分の個々のプレート(プレートあたり1ワーム)に50〜100 F1 Rolワームをシングルアウトし、卵を産むことを可能にします。 L4段入りF1 ロルワームが卵を産み、1〜2日間子孫(F2)を生成することを許可します。 9. 単一ワームのリシスとPCR F2を1〜2日間生産した後、各シングルF1ロルマザーを2.5μLの溶解バッファー (表2)に移し、1:100希釈して20mg/mLプロテイナーゼKを行います。 チューブを-30°Cで20分間凍らせます。ワームは、さらなる分析まで長期間この段階で保存することができます。 1時間、95°C、15分間、4°Cで保持する:PCRサーモサイクラー上で単一のワームのリシスを行います。 以下の試薬をPCRチューブを含むリセドワームの2.5 μLに直接添加します:dMP、DNAポリメラーゼ、MgCl2 およびローディング色素を含む2x PCRミックスの12.5 μL、10 μMフォワードプライマーの1 μL、1μLの10 μM逆プライマー、滅菌水を22.5μLにします。各PCR反応の総体積は25μLです。注:複数のF1 ワームをスクリーニングする場合、複数の反応に対してPCRマスターミックスを作成し、各ライシスチューブに22.5 μLのマスターミックスを追加する方が高速で便利です。 サーモサイクラーにPCR反応を設定し、1分間95°C、15sで95°Cの35サイクル、15sの55°C(プライマーセットごとに最適化)、72°C(各標的DNAに最適化)44。4 °Cで反応を保持します。 10. 制限消化とアガロースゲル電気泳動 注意: 制限の消化は、小さな編集(50 bp未満)のスクリーニング中にのみ必要です。 ステップ9から新しいチューブにPCR DNAの10 μLを移します。 15 μL反応あたり、2~4単位の制限酵素と1x制限酵素バッファー(1.5 μLの10x反応バッファー)を加えます。 37°C(または他の酵素特異的温度)で2時間インキュベートする(速効性酵素でインキュベーション時間を短くすることができる)。 PCRチューブを65°C(または他の酵素特異的温度)で10〜15分間加熱することで、制限消化を不活性化します。 各PCRチューブから1%-2%のアガロースゲルの単一ウェルに反応全体をロードし、適切なバンド分離が達成されるまでゲルを110 mAで実行します。注: アガロースゲルでの走行中に、可視化用に既に荷重染料が含まれている PCR ミックスを使用しています。この混合は、制限消化反応を妨げないので、一度に多くのワームをスクリーニングするために使用するのに便利です。 11. 積極的に編集されたワームを特定する DNAバンドサイズを検出するためにUV光(臭化エチジウムゲル用)の下でアガロースゲルを可視化します。注:正に編集されたワームは、ワームゲノム内の所望の軌跡に制限部位を運ぶ修復テンプレートを使用して編集するため、期待されるサイズでDNAの余分なバンドを表示します。F1 ローラーワームは編集のためにヘテロ接数であることが予想されるため、3 つのバンド(1 つの野生型のノーカット PCR 産物と編集されたカット PCR 産物からの 2 つの小さなフラグメント)が表示されると予想されます。まれですが、ホモ接合が時折起こるのは注意が必要です。 編集の存在がサンガーシーケンシングによって確認されるまで、元の正に編集されたプレートをすべて保存します。 12. ホモザイゴス編集対象 各正に編集されたF1 Rolワームプレートから8〜12野生型の非ローリングF2ワームを選び、卵を産み、1〜2日間子孫を生成することができます。注 :C.エレガンス は雌雄同体を自己受精しているので、編集されたアレルが生存率または発達に影響しない場合、予想されるホモ接合突然変異体の割合は約25%であるべきである。非ローリングF2 ワームは 、dpy-10 遺伝子座の野生型でなければなりません。非転動ワームを選ぶことは 、dpy-10(cn64) 突然変異を失い、目的の遺伝子でのみ突然変異を持つ編集されたワームの生成を可能にします。 なお 、dpy-10 遺伝子は染色体II上に存在する。あなたの関心のある遺伝子が dpy-10にリンクされている場合 、dpy-10 突然変異を目的の遺伝子から簡単に分離できない場合があります。 手順 9 ~ 11 を実行して、ホモ接合のワーム ラインを特定します。 13. シーケンスによる編集の確認 ホモ接合性ワームが同定されたら、ステップ9で説明したように、ライシスおよびPCRを行う。 各ホモ接合ラインに対して少なくとも3つのPCR反応を配列化するように設定します。 PCR精製キットを使用して PCR 反応を精製します。 ナノドロップ分光光度計を用いてDNA濃度を測定する。 サンガーシーケンシング用の各前方プライマーでサンプルを送信します。順次プライマーが、シーケンス処理する編集から少なくとも 50 基の距離になるように設計されていることを確認します。 シーケンス解析ソフトウェアを使用してシーケンス結果を分析し、編集の有無を確認します。