CRISPR/Cas9 Editing of the <em>C. elegans rbm-3.2</em> Gene using the <em>dpy-10</em> Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Amy Smith; Mary Bergwell; Ellie Smith; Danita Mathew; Jyoti Iyer

doi:10.3791/62001

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genetics

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

Published: December 11, 2020

doi:

10.3791/62001

Amy Smith¹, Mary Bergwell*¹, Ellie Smith*¹, Danita Mathew*¹, Jyoti Iyer¹

¹Department of Chemistry and Biochemistry,The University of Tulsa

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

Abstract

מערכת החלבון (Cas) הקשורה לצריכים משולבים באופן קבוע הבין-מרחבית (CRISPR)/ מערכת החלבון (Cas)הקשורה לסטרפטוקוקוס Pyogenes CRISPR נרתמה על ידי החוקרים כדי לחקור בעיות חשובות הרלוונטיות ביולוגית. העוצמה שאין כדוגמתה של שיטת עריכת הגנום CRISPR/Cas מאפשרת לחוקרים לערוך במדויק כל לוקוס לפי בחירתם, ובכך להקל על הבנה מוגברת של תפקוד הגנים. מספר שיטות לעריכת הגנום C. elegans על ידי CRISPR /Cas9 תוארו בעבר. כאן, אנו דנים ומדגימים שיטה המשתמשת במתחמי ריבונוקליאופרוטאין מורכבים במבחנה ובסמן DPY-10 CO-CRISPR להקרנה. באופן ספציפי, במאמר זה, אנו עוברים את התהליך שלב אחר שלב של החדרת קודונים עצירה מוקדמת לתוך הגן C. elegans rbm-3.2 על ידי תיקון בהורולוגיה מכוונת באמצעות שיטה זו של עריכת CRISPR / Cas9. שיטת עריכה פשוטה יחסית זו יכולה לשמש כדי ללמוד את הפונקציה של כל גן של עניין ומאפשרת את הדור של הומוזיגוס ערוך C. elegans על ידי עריכת CRISPR / Cas9 בתוך פחות משבועיים.

Introduction

טכנולוגיית החלבון (Cas) המשודרגת באופן קבוע בין-מרחבית (CRISPR)/ טכנולוגיית החלבון (Cas) הקשורה לסטרפטוקוקוס Pyogenes CRISPR מאפשרת עריכת גנום ממוקד יעילה במגוון רחב של אורגניזמים¹^,²^,³^,⁴. מערכת CRISPR התגלתה לראשונה כחלק מתגובה חיסונית פרוקריוטית אנטי ויראלית^5,^6,⁷. מערכת CRISPR מסוג II משתמשת באנדונוקלאז כגון Cas9, RNA מבצע הפעלה (tracrRNA) ומדריך ארוך 20-נוקלאוטידים קצרים, ספציפיים לדנ”א, CRISPR RNA (crRNA) כדי לזהות מוטיב סמוך של פרוטו-ספייסטר (PAM) של Protospacer “NGG) ולבצע הפסקה כפולה בדנ”א היעד⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². הפסקה כפולה זו מוכרת כנגע על ידי מכונות תיקון הדנ”א הסלולריות. כתוצאה מכך, ניתן לתקן את ההפסקה הכפולה שנוצרה על ידי אחד משני מסלולים – i) הצטרפות לא הומולוגית (NHEJ) או ii) תיקון מונחה ההומולוגיה (HDR)¹³. NHEJ הוא לעתים קרובות נוטה שגיאה ולכן, כאשר מסלול זה משמש כדי לתקן את השבר הכפול תקוע ב- DNA היעד, זה לעתים קרובות גורם מוטציות לא מעשיות (הוספות, מחיקות) בגן העניין. מצד שני, על ידי אספקת תבנית תיקון אקסוגני עם הומוולוגיה לשני צדי השבר הכפול, ניתן לכוון את מכונות תיקון ה- DNA הסלולריות להשתמש ב- HDR כדי לתקן את ההפסקה¹³. שיטת HDR מאפשרת אפוא עריכה מדויקת של כל מוקד עניין.

מגוון פרוטוקולים לעריכת גנים CRISPR/Cas9 תוארו עבור C. elegans¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. שיטות העריכה הנפוצות ביותר של CRISPR/Cas9 ב- C. elegans כוללות פרוטוקולים מבוססי שיבוט וללא שיבוט ליצירת^{תבניות תיקון}עבור CRISPR/Cas9 עריכה 14^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. פרוטוקול זה דן בפירוט בפרוטוקול עריכה של CRISPR/Cas9 ללא שיבוט המבוסס על שימוש ב- dpy-10 כסמן CRISPR משותף להקרנה. עד כה, פרוטוקול הווידאו היחיד המפורט C. elegans-המתמקד ב- CRISPR/ Cas9 שקיים משתמש בסמן פלואורסצנטי להקרנה²¹. עם זאת, שימוש בסמן פלואורסצנטי להקרנה דורש גישה למיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר מעבדות רבות במוסדות קטנים בעיקר לתואר ראשון (PUIs) עשויים להתקשות לגשת אליו. מעודד לציין כי תוצאות מתאם חיוביות התקבלו במחקרים קודמים בין תולעים הנושאות סמנים פלואורסצנטיים לבין נוכחות של העריכה²¹^,²². עם זאת, מחקרים נוספים נחוצים כדי לקבוע את היעילות הכוללת של שיטת ההקרנה מבוססת הפלואורסצנטיות לעריכת מגוון רחב של loci עם RNAs מדריך שונים ותבניות תיקון. לבסוף, מאז קידוד plasmids עבור סמנים פלואורסצנטיים אלה יוצרים מערכים חוץכרומוזומליים, פלואורסצנטיות משתנה מופקת לעתים קרובות מערכים אלה שיכולים להקשות על זיהוי²³. לפיכך, למרות שיטת ההקרנה המבוססת על פלואורסצנטיות עשויה להיות שימושית לאימוץ, הבעיות הנ”ל עשויות להגביל את תחולתה.

באמצעות סמן CRISPR משותף המייצר פנוטיפ גלוי מפחית מאוד את מספר הצאצאים שיש לסנן כדי למצוא תולעת ערוכה חיובית²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸. חשוב לציין, פנוטיפים המיוצרים על ידי סמנים אלה ניתן לזהות בקלות תחת מיקרוסקופ פשוט לנתח^23,²⁴^,²⁵^,^26,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³^,³⁴. סמן DPY-10 Co-CRISPR הוא אחד הסמנים הטובים ביותר המאופיינים הנפוצים ביותר של CO-CRISPR לביצוע C. elegans CRISPR/ Cas9 עריכת גנום²⁴^,²⁷. לכן, מאמר זה ידון בשיטה של ביצוע CRISPR/Cas9 עריכה C. elegans באמצעות משלוח ישיר של מתחמי ריבונוקליאופרוטאין עם dpy-10 כסמן CRISPR משותף²⁷^,³⁵. בשיטה זו, תערובת הזרקת העריכה המוכנה מורכבת מ- dpy-10 crRNA ומאופיין היטב ותבנית תיקון dpy-10 כדי לתווך את הדור של פנוטיפ דומיננטי “רולר” (רול) הנצפה המוענק על ידי מוטציה הטרוזיגוס dpy-10(cn64) בתוך הגן dpy-10 ²⁴^,²⁷^,²⁹. כאשר קיים במצב הומוזיגוס שלה, המוטציה dpy-10(cn64) גורמת פנוטיפ מפמפמר (Dpy) אשר מייצר תולעים קצרות יותר ו stouter²⁴^,²⁹. הפנוטיפ של רול מתווך על ידי החדרה מדויקת של תבנית התיקון Dpy-10 שסופקה במשותף לעותק יחיד של הגן dpy-10 על ידי עריכת CRISPR/Cas9 בתיווך HDR. לכן, המראה של Rol C. elegans מציין הזרקה מוצלחת, כמו גם אירוע עריכה מוצלח בתיווך HDR בתוך תאי התולעת המוזרקת. מאז crRNA ואת תבנית התיקון של גן היעד של עניין נמצאים באותו תערובת הזרקה עם dpy-10 crRNA ותבנית תיקון dpy-10, יש סיכוי טוב כי תולעי רול מזוהה היו גם בו זמנית נערך בגן היעד של עניין. לפיכך, תולעי רול אלה נבדקות לאחר מכן לעריכת עניין על ידי טכניקות כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) (לעריכות גדולות מ -50 bp) או על ידי PCR ואחריו עיכול הגבלה (לעריכות פחות מ 50 bp).

היתרונות של שימוש בשיטה זו לעריכת גנום הם: i) עריכות CRISPR יכולות להיווצר ביעילות גבוהה יחסית (2% עד 70%) בשיטה זו²⁷; ii) תבניות התיקון ו- RNAs המדריך המשמשים בשיטה זו אינם כרוכים בשיבוט, ובכך מצמצמים את הזמן הנדרש לדור שלהם; iii) על ידי הרכבת מתחמי ריבונוקליאופרוטאין במבחנה, ריכוזי מתחמי העריכה המורכבים יכולים להישמר קבועים יחסית, ובכך לשפר את יכולת הרבייה; iv) כמה RNAs מדריך שאינם מצליחים ליצור עריכות כאשר מבוטאים מ plasmids הוכח לעבוד עבור עריכת הגנום CRISPR / Cas9 כאשר מסופק כמו הפריה מובחנת crRNAs²⁷; v) כולל סמן Dpy-10 co-CRISPR מאפשר סינון קל באמצעות מיקרוסקופ מנתח ומקטין את מספר הצאצאים שיש לסנן כדי למצוא חיובי²⁴^,²⁷; ו vi) DNA ריצוף קווי תולעת מוערכת הומוזיגוס מאומת ניתן להשיג בשיטה זו בתוך כמה שבועות¹⁹^,²⁷.

פרקי ספרים מצוינים הנוגעים לשיטות רבות ושונות של C. elegans CRISPR^{פורסמו 14,}¹⁵^,^16,¹⁷^,¹⁸^,^19,²⁰^,⁴³. עם זאת, ההדגמה של שיטת Dpy-10 co-CRISPR בפורמט וידאו בהגדרת מעבדה חסרה כעת. במאמר זה, אנו מתארים ומדגימים את תהליך השימוש בשיטת dpy-10 co-CRISPR לעריכת גן יעד מייצג בשם rbm-3.2, חלבון מחייב RNA putative (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). באופן ספציפי, כאן אנו מתארים בפירוט את השיטה של החדרת שלושה קודונים עצירה מוקדמת בתוך הגן C. elegans rbm-3.2 באמצעות מתחמי ריבונוקליאופרוטאין מורכבים במבחנה ותבנית תיקון ליניארית חד-גדילית שסופקה באופן אקסוגני. מחקרים אלה הצליחו לייצר את זן C. elegans CRISPR הראשון עם קודונים לעצור מוקדם בגן rbm-3.2. מאז לא הרבה ידוע כיום לגבי הפונקציה של גן זה C. elegans, זן זה ישמש ככלי שימושי לנתח את הפונקציה של RMB-3.2. שיטה זו יכולה גם להיות מאומצת כדי להפוך הוספות, תחליפים ומחיקות בכל לוקוס בתוך הגנום C. elegans.

Protocol

פרוטוקול זה לעריכת הגנום CRISPR/Cas9 אושר על ידי הוועדה לבטיחות ביולוגית מוסדית של אוניברסיטת טולסה בהתאם להנחיות NIH. לאורך הפרוטוקול הזה, טכניקה סטרילית תרגלה. כל השלבים של פרוטוקול זה בוצעו באמצעות ריאגנטים שהיו נקיים מגרעין. טיפול מיוחד ננקט כדי למנוע זיהום RNase כגון כפפות ניקוי, כמו גם סביבות עבודה וציוד (למשל pipettes, חיצוני של כלי זכוכית, וכו ‘) עם פתרון טיהור RNase. 1. עיצוב קרנה מצא את ה- PAM המאפשר ל- Cas9 לחתוך הכי קרוב לאתר העריכה. אתר PAM הוא 5’-NGG-3 ‘. זכור כי PAM יכול להיות על כל גדיל של ה- DNA. בחר 20 bp בקצה 5’ של PAM כרצף crRNA.הערה: רצף crRNA בפועל המסונתז על ידי חברות מסחריות הוא ארוך מ- 20 bp מכיוון שיש לו רצף כללי נוסף המתווסף באופן אוטומטי לרצף crRNA ספציפי ליעד של 20 bp על-ידי חברת הסינתיזה. לגבי השפעות מחוץ למטרה, מחקרים אחרונים לא מצאו השפעות מחוץ למטרה של Cas9 ב C. elegans36,37,38,39,40. יתר על כן, הזנים שנערכו על-ידי CRISPR הם outcrossed. לכן, אנחנו לא מודאגים מאוד על השפעות מחוץ למטרה של crRNAs מעוצב. עם זאת, אתרי אינטרנט מקוונים, כולל http://genome.sfu.ca/crispr/ http://crispor.tefor.net/ יכולים לשמש כדי למצוא ולבחור את crRNAs עם האפקטים הפחות מחוץ למטרה38,41. crRNAs המסתיימות עם G או GG ואלה עם יותר מ 50% תוכן GC צפויים להיות יעילים יותר19,23,42. הזמינו לפחות 10 ננומטר של crRNA מחברה (למשל IDT, Horizon Discovery וכו ‘). ברגע שה-crRNA המועבר מגיע, אחסנו אותו ב-30 מעלות צלזיוס עד ליום המיקרו-ינון. ביום ביצוע המיקרו-אנז’ק, סובבו את ה-crRNA lyophilized במהירות המרבית (17,000 x g) למשך דקה אחת והעבירו אותו מחדש ל-5 מ”מ טריס-קל (pH 7.4) כדי לייצר מלאי של 8 מיקרוגרם/מיקרו-אל של ה-CRRNA. אחסן את מלאי crRNA שאינו בשימוש קפוא ב -80 °C (70 °F). 2. תיקון עיצוב תבנית הורד תוכנת מניפולציה רצף (למשל מציג רצף CLC, APE, Snapgene, וקטור NTI, וכו ‘). אנו משתמשים ב- CLC רצף מציג גירסה 8.0 (Qiagen) כפי שהוא ידידותי למשתמש וניתן להוריד בחינם. הדבק את הרצף של DNA היעד של עניין לתוך מציג הרצף. הכיוון של תבנית התיקון משפיע על יעילות העריכה28. להוספת רצף תיקונים לקצה 5’ של ה- PAM, עצב תבנית תיקון חד-גדילית עם רצף DNA מאותו גדיל DNA שעליו ממוקם רצף PAM (גדיל protospacer)28. בעוד להכנסת רצף תיקון לסוף 3 ‘ של PAM, לעצב תבנית תיקון חד גדילי עם רצף DNA מ גדיל ה- DNA שאינו נושא את רצף PAM (גדיל מרווח)28. בחר 35 זוגות בסיס של רצף עם הומולוגיה ללא הפרעות משני הצדדים (בקצה 5′ ו- 3’) של העריכה. ערוך מוטציה או מחק את ה- PAM כדי למנוע חיתוך של תבנית התיקון או ה- DNA הגנומי הערוך על-ידי Cas9. אם המוטציה של PAM אינה אפשרית, הצג מספר מוטציות שקטות קרוב לקצה 5 ‘ של PAM כדי למנוע חיתוך של תבנית התיקון או ה- DNA הגנומי הערוך. הקפד להציג מוטציות שקטות של PAM רק אם הוא קיים באזור אקסוני. בדוק את תדירות השימוש בקודון כדי לוודא שהקודון שעבר מוטציה מוצג בתדר הדומה לקודון המקורי שאינו שעבר מוטציה (למשל https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). במקרים מסוימים, ייתכן שלא ניתן יהיה להציג את קודון מוטציה בתדר דומה לקודון שלא עבר מוטציה. עם זאת, עבור ביצוע מוטציות של כמה חומצות אמינו, אנחנו לא מצפים את רמת הביטוי של חלבון מוטציה להשתנות באופן משמעותי. אם העריכה קטנה (למשל מוטציה של כמה בסיסים), הצג אתר הגבלה ייחודי קרוב לעריכה על-ידי מוטגנזה שקטה. אנו משתמשים http://heimanlab.com/cut2.html כדי למצוא אתרי הגבלה שניתן להציג על ידי mutagenesis שקט. בדוק את תדירות השימוש בקודון כדי לוודא שהקודון שעבר מוטציה מוצג בתדר הדומה לקודון המקורי שאינו שעבר מוטציה. כאמור לעיל, זה לא תמיד אפשרי. עם זאת, עבור ניסויים הכוללים מוטציות של כמה חומצות אמינו, איננו מצפים שרמת הביטוי של החלבון המוטנטי תשנה באופן משמעותי. לסנתז ולרכוש תבניות תיקון ליניאריות חד גדיליות עבור HDR כמו 4 נמול אולטרה-אמר אוליגוס. Resuspend תבנית תיקון אוליגונוקלאוטיד ליאופילי במים ללא נוקלאז כדי להפוך מלאי 1 מיקרוגרם / μL של תבנית התיקון ולאחסן אותו ב -30 °C (50 °F) עד לשימוש נוסף. 3. עיצוב פריימר הקרנה באמצעות מציג רצף CLC או יישומים דומים אחרים, עצב 20 עד 23 פריימרים קדמיים והפוך משני צדי העריכה בהתאמה, כך שהם מייצרים רצועה של בין 400 ל -600 זוגות בסיס על הגברת PCR. עבור הוספות גדולות יותר בגודל של מספר קילו-בסיסים, עצב את הפריימר הקדמי שיהיה ממוקם ממש מחוץ לזרוע ההומולוגית השמאלית של תבנית התיקון. עצב את הפריימר ההפוך כך שימוקם בתוך תבנית התיקון עצמה. במקרה זה, מוצר PCR יתקבל רק במקרה של תולעים ערוכות באופן חיובי. כדי לזהות תולעים בעריכת הומוזיגוס עבור הוספות ארוכות יותר, להגביר את כל אזור הכניסה על-ידי עיצוב פריימרים קדימה ואחורה הממוקמים מחוץ לצומת הכניסה. בדוק את הפריימרים ולייעל את תנאי PCR עם DNA גנומי מסוג פראי לפני השימוש בפריימרים עבור genotyping. ודא כי רצועה אחת בגודל צפוי מיוצר על הגברת PCR של ה- DNA הגנומי (במידת הצורך). 4. הכנת תולעים צעירות להזרקה בחר L2-L3 שלב C. elegans על דשא חיידקי טרי על צלחת MYOB ודגורה ב 20 °C (70 °F) לילה.הערה: הפרוטוקול להכנת לוחות MYOB ניתן למצוא כאן: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/ ביום המיקרו-שיתוף, בחר תולעים צעירות עם פחות מ-10 עוברים ברחם כדי להזריק. 5. הכנת תערובת ההזרקה הכן את תערובת ההזרקה באותו סדר כפי שמוצג בטבלה 1 בצינורות סטריליים ללא נוקלאז.הערה: הרכיבים של תערובת ההזרקה ניתן להקטין כדי להפוך 5 תערובות הזרקת μL (במקום 20 μL) אם זריקות עתידיות עם תערובת זו אינם צפויים. מערבבים את תערובת ההזרקה על ידי צנרת. לדגור את תערובת ההזרקה ב 37 °C במשך 15 דקות כדי להרכיב קומפלקסים ריבונוקליאופרוטאין. ספין את תערובת ההזרקה ב 4 °C ב 17,000 x g במשך 5 דקות. 6. מיקרו-ג’קציה לגונד C. elegans בצע מיקרו-ג’ק-קציה של תערובת הזרקת CRISPR לתוך גונד C. elegans, כמתואר באייר ואח ‘ 201943. הזריקו כ-30 תולעים עם תערובת הזרקת CRISPR. תערובת הזרקה בשימוש ניתן להשתמש מחדש על ידי אחסון ב 4 מעלות צלזיוס לתקופה של כ 6 חודשים ללא אובדן יעילות49. הזריקו את שתי זרועות ההונאה במידת האפשר. תולעים מוזרקות נחשבות לדור P0. 7. התאוששות והעברה של תולעים מוזרקים לאחר מיקרו-שיתוף פעולה, הזיזו את תולעי ה-P0 הזעיר באמצעות פיק תולעת לצלחת אגר MYOB באורך 60 מ”מ עם OP50 E. coli ותנו להן להתאושש בטמפרטורת החדר למשך כשעה. שים לב כי טמפרטורת ההתאוששות תהיה תלויה הגנוטיפ של התולעים המוזרקות. לדוגמה, עבור זנים רגישים לטמפרטורה, התאוששות תולעת בטמפרטורה אחרת עשויה להיות נחוצה. באמצעות פיק תולעת חוט פלטינה, להעביר כל תולעת מוזרקת על צלחת פטרי 35 מ”מ MYOB אגר יחיד ולאפשר להם להטיל ביצים ב 20 °C (70 °F) עד למחרת. שים לב כי כמה תולעים ימותו כתוצאה מפציעה מהליך microinjection. רק לבחור את התולעים האלה כי הם חיים ולהציג תנועה. לאחר 24 שעות, להעביר את התולעים מוזרק לוחות בודדים חדשים (1 תולעת לכל צלחת). 8. בחירת C. elegans להקרנה 3 עד 4 ימים ב 20 מעלות צלזיוס לאחר ההזרקה בוצעה, לפקח על כל הצלחות המכילות את הצאצאים של התולעים מוזרק באמצעות מיקרוסקופ ניתוח. זהה צלחות שיש להם F1 צאצאים המציגים רולר (רול) ופנוטיפים שמנמנים (Dpy). פנוטיפ Dpy הוא המקום שבו תולעים מופיעות קצרות יותר ותייצבות יותר מאשר תולעי שליטה באותו שלב התפתחותי (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0–10). לוחות עם תולעי רול ו Dpy מייצגות לוחות שבהם הצאצאים F1 נערכו בהצלחה עם המוטציה dpy-10(cn64) להיות נוכח במצב הטרוזיגוס או הומוזיגוס, בהתאמה. בחר את הצלחות עם התולעים הגליליות והמנושלות ביותר להקרנה. יחיד 50 עד 100 תולעי רול F1 מלוחות אלה ללוחות בודדים משלהם (1 תולעת לצלחת) ולאפשר להם להטיל ביצים. אפשר לתולעי F1 רול מבוימים L4 להטיל ביצים ולייצר צאצאים (F2)למשך 1 עד 2 ימים. 9. תמוגת תולעת בודדת ו- PCR לאחר הפקת F2 במשך 1 עד 2 ימים, להעביר כל יחיד F1 רול אמא לתוך 2.5 μL של חיץ תמוז (טבלה 2) עם דילול 1:100 של 20 מ”ג / מ”ל Proteinase K. להקפיא את הצינורות ב -30 °C (50 °F) במשך 20 דקות. התולעים ניתן לאחסן בשלב זה לתקופה ממושכת עד ניתוח נוסף. בצע תמוגת תולעת יחיד על thermocycler PCR עם התנאים הבאים: 60 °C (60 °F) במשך שעה אחת, 95 °C (55 °F) במשך 15 דקות ולהחזיק ב 4 °C (50 °F). הוסף את הריאגנטים הבאים ישירות ל 2.5 μL של התולעת lysed המכיל צינור PCR: 12.5 μL של 2x תמהיל PCR המכיל dNTPs, DNA פולימראז, MgCl2 וצבע טעינה, 1 μL של 10 μM פריימר קדימה, 1 μL של 10 μM פריימר הפוך, ומים סטריליים ל 22.5 μL. הנפח הכולל של כל תגובת PCR הוא 25 μL.הערה: במקרה של הקרנת תולעי F1 מרובות, זה מהיר ונוח יותר לעשות PCR מאסטר-לערבב עבור תגובות מרובות ולהוסיף 22.5 μL של תערובת מאסטר לכל צינור תמוגה. הגדר תגובות PCR על thermocycler עם התנאים הבאים: 95 °C למשך 1 דקה, 35 מחזורים של 95 °C (15 °F) עבור 15 s, 55 °C (אופטימיזציה עבור כל ערכת פריימר), 72 °C (1 דקה (לייעל עבור כל DNA היעד)44. החזק תגובות ב 4 °C (5 °F). 10. הגבלת העיכול ואלקטרופורזה של ג’ל אגרוז הערה: עיכול הגבלה הוא הכרחי רק בעת הקרנה עבור עריכות קטנות (פחות מ 50 bp). העבר 10 μL של ה- DNA PCR מהשלב 9 לצינור חדש. הוסף בין 2 ל 4 יחידות של אנזים הגבלה חוצץ אנזימים הגבלה 1x (1.5 μL של 10x מאגר תגובה) לכל 15 μL תגובה. דגירה בטמפרטורה של 37 °C (או בטמפרטורה ספציפית אחרת לאנזים) למשך שעתיים (זמני דגירה קצרים יותר עשויים להיות אפשריים עם אנזימים הפועלים במהירות). חום לנטרל את עיכול ההגבלה על ידי חימום צינורות PCR ב 65 °C (או טמפרטורה ספציפית אחרת אנזימים) במשך 10 עד 15 דקות. לטעון את התגובה כולה מכל צינור PCR לתוך באר אחת של 1%-2% ג’ל אגרוז ולהפעיל ג’ל ב 110 mA עד הפרדת פס נכונה מושגת.הערה: אנו משתמשים בתערובת PCR שכבר כוללת צבע טעינה לוויזיה בזמן ריצה על ג’ל אגרוז. תערובת זו אינה מפריעה לתגובת העיכול המגבלה ולכן נוח לשימוש להקרנת תולעים רבות בבת אחת. 11. זיהוי תולעים ערוכות באופן חיובי דמיינו ג’לים אגרוז תחת אור UV (עבור ג’לים ברומיד אתידיום) כדי לזהות גדלי רצועת DNA.הערה: תולעים בעריכה חיובית יציגו רצועה נוספת של DNA בגודל הצפוי עקב עריכה באמצעות תבנית התיקון הנושאת את אתר ההגבלה בלוקוס הרצוי בתוך הגנום של התולעת. תולעי רולר F1 צפויות להיות הטרוזיגוס לעריכה ולכן צפויות להציג שלוש רצועות (מוצר PCR לא חתוך מסוג פראי אחד ושני שברים קטנים יותר ממוצר PCR החתוך הערוך). למרות שזה נדיר, יש לציין כי הומוזיגוטים אכן מתעוררים מדי פעם. שמור את כל הלוחות המקוריים שנערכו באופן חיובי עד שנוכחות העריכה מאומתת על-ידי רצף Sanger. 12. עריכת הומוזיגוס של עניין בחר בין 8 ל -12 תולעי F2 שאינן מתגלגלות מסוג בר מצלחות התולעת F1 Rol בעריכת חיובית בהתאמה ולאפשר להם להטיל ביצים ולייצר צאצאים במשך יום עד יומיים.הערה: מאז C. elegans הם הפריה עצמית הרמפרודיטים, אם האלל הערוך אינו משפיע על הכדאיות או ההתפתחות, שיעור המוטנטים ההומוזיגוס הצפויים צריך להיות כ -25%. תולעי F2 שאינן מתגלגלות חייבות להיות מסוג פראי עבור הלוקוס dpy-10. בחירת תולעים שאינן מתגלגלות מאפשרת יצירת תולעים ערוכות שאיבדו את המוטציה dpy-10(cn64) ויש להן רק את המוטציה בגן העניין שלך. שים לב כי הגן dpy-10 קיים על כרומוזום II. אם גן העניין שלך מקושר ל- dpy-10, ייתכן שלא תוכל בקלות להפריד את מוטציית dpy-10 הרחק גן העניין שלך. בצע שלבים 9 עד 11 כדי לזהות קווי תולעת הומוזיגוס. 13. אשר עריכה על ידי רצף לאחר שתולעי הומוזיגוס מזוהות, בצע תמוגה ו- PCR כמתואר בשלב 9. הגדר לפחות 3 תגובות PCR עבור כל קו הומוזיגוס לרצף. טהרו את תגובות ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR. מדוד ריכוז דנ”א באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפה. שלח דוגמה עם פריימר קדימה בהתאמה עבור רצף סנגר. ודא שהקדימה הקדמית מתוכננת להיות במרחק של 50 בסיסים לפחות מהעריכה שיש לרצף. נתח את תוצאות הרצף באמצעות תוכנת ניתוח רצף כדי לאשר את נוכחות העריכה.

Representative Results

rbm-3.2 הוא חלבון מחייב RNA פואטי שיש לו הומולוגיה לגורם גירוי מחשוף אנושי subunit 2 גרסה טאו (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). חלבון RBM-3.2 זוהה כשותף מחייב של חלבון פוספטאז 1 (GSP-1) והרגולטורים שלו מעכב-2 (I-2SZY-2) ו- SDS-22 במחקר קודם שזיהה חלבונים אלה כרגולטורים חדשניים של שכפול צנטריואלה C. elegans (נתונים שאינם מוצגים)45. נכון לעכשיו, מעט מאוד ידוע לגבי הפונקציה של הגן rbm-3.2 ב C. elegans. לפיכך, כדי לחקור עוד יותר את התפקיד הביולוגי של הגן C. elegans rbm-3.2, הגן rbm-3.2-null allele rbm-3.2 (ok688) התקבל מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC). למרבה הצער, בנוסף למחיקה של כל הגן rbm-3.2, אלל rbm-3.2(ok688) גם גורם למחיקה חלקית של גן חופף, rbm-3.1, ובכך לסבך ניתוח גנטי. לכן, על מנת לחקור במדויק את תפקידו של הגן rbm-3.2 ב- C. elegans, השתמשנו בעריכה CRISPR/Cas9 כדי להציג שלושה קודונים של עצירה מוקדמת קרוב מאוד לתחילת אזור הקידוד C. elegans rbm-3.2, והשארנו את הגן החופף rbm-3.1 ללא פגע. כדי להכניס את קודוני העצירה המוקדמים האלה לגן C. elegans rbm-3.2, עיצבנו crRNA עם מוטיב PAM שהיה ממוקם על הגדיל הנגדי (גדיל תבנית) של DNA ( איור1A). אתר החיתוך Cas9 היה ממוקם במרחק של 6 בסיסים מההתחלה של rbm-3.2 start ATG. כדי להכניס קודונים לעצור מוקדם לתוך הגן rbm-3.2, עיצבנו תבנית תיקון עם חמשת המאפיינים העיקריים הבאים: 1) 35 בסיסים של הומוולוגיה ללא הפרעה כדי rbm-3.2 במעלה הזרם של rbm-3.2 להתחיל קודון (זרוע הומולוגיה שמאל) 2) רצועה קצרה של בסיסים המכילים את מוטיב PAM נמחק 3) אתר הגבלת EcoRI הוצג מיד לאחר ההתחלה קודון להקרנה 4) הקודונים השני והשלישי של rbm-3.2 נמחקו שלושה קודונים לעצור הוצגו לאחר קודון RBM-3.2 החמישי להפסיק תרגום של rbm-3.2 mRNA 5) 35 בסיסים של הומוולוגיה ללא הפרעה אל intron הראשון של rbm-3.2 נכללו במורד הזרם של העריכה (זרוע ההומולוגיה הימנית) ( איור1B). תערובת ההזרקה לניסוי CRISPR זה הוכן כפי שצוין בטבלה I. תערובת ההזרקה הייתה דגירה ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות להרכיב מתחמי ריבונוקליאופרוטאין. התמהיל היה אז צנטריפוגה והועמס לתוך מחט microinjection משך. מיקרו-ג’ינט לתוך תותח C. elegan’sgonad בוצע כמתואר באייר ואח ‘201943. איור 2 מתאר את ציר הזמן הניסיוני ליצירת אלגנים ערוכים באמצעות פרוטוקול זה. למרות שאנחנו בדרך כלל להזריק 30 תולעים עבור כל ניסוי CRISPR, מעבדות מסוימות להזריק פחות תולעים (בין 10 ל 20) עבור כל ניסוי CRISPR. מאז הזרקת תולעים יותר מגביר את ההסתברות למצוא עריכות חיוביות, אנו מעדיפים להזריק מספר גדול יותר של תולעים. מעבדות רבות בוחרות “קופה” מהורהרים (צלחות עם יותר מ -50% צאצאי רול ו- Dpy) להקרנה. מניסיוננו לאחר ביצוע מספר ניסויי CRISPR, אם כי גוזלים קופה להתעורר מדי פעם, רוב הפעמים, תולעי רול שנבחרו להקרנה לעתים קרובות מגיעות מלוחות P0 שונים רבים, כל אחד מורכב כמה צאצאי רול. לא הושגו גוזלים בכל הקופה בניסוי הזה. בסך הכל, הקרננו את הדנ”א הגנומי של תולעי רול 73 F1 שהושגו מ-7 תולעי P0 מוזרקות לנוכחות העריכה. הרצפים של פריימרים ההקרנה והמיקומים שלהם ביחס לקודון ההתחלה של הגן rbm-3.2 מיוצגים באיור 3A. באמצעות הניתוח שלנו, 7 מתוך 73 תולעי F1 נמצאו חיוביות לעריכה (9.5%) (איור 3B). תולעים לא ערופות הציגו שבר דנ”א יחיד של 445 bp על עיכול EcoRI. בעוד, תולעים הנושאות קודון עצירה מוקדמת בגן rbm-3.2 הציגו שני שברים של 265 bp ו 166 bp בהתאמה על עיכול EcoRI. תולעים בעריכת Heterozygous הציגו שלושה שברים על עיכול EcoRI: שבר DNA אחד מסוג בר לא ערוך של 445 bp ושני שברי DNA של 265 bp ו 166 bp בהתאמה מן העותק הערוך של הגן rbm-3.2. כדי לזהות תולעים הנושאות עריכות הומוזיגוס, העברנו 12 תולעי F2 מהטרוזיגוטים החיוביים שזוהו F1 ללוחות בודדים חדשים ואפשרנו להם לייצר צאצאים (F3). תולעי F2 נבדקו אז להומוזיגוזיות כפי שתואר קודם לכן. 6 מתוך 12 (50%) תולעים מוקרנות נמצאו כהומוזיגוס לעריכת העניין שלנו (איור 4A). הדנ”א הגנומי של קו תולעת מזוהה בעריכת הומוזיגוס שימש כדי להגדיר תגובת ריצוף דנ”א. ניתוח ריצוף DNA אישר את נוכחות העריכה במצב ההומוזיגוס שלה (איור 4B). באופן כללי, זה מועיל לרצף קווי תולעת הומוזיגוס מרובים כדי להבטיח כי כל קווי התולעת בעריכת הומוזיגוס להפגין את אותו פנוטיפ (אם מוטציה null מייצר פנוטיפ ספציפי). יתר על כן, ייתכן שיהיה צורך גם לאמת נוקאאוטים גנים באמצעות בדיקה מבוססת ביטוי כגון סופג מערבי או RT-PCR או באמצעות ניתוח פנוטיפ. הסיבה לכך היא, ייתכן כי למרות הצגת קודונים להפסיק מוקדם בתחילת הגן, ATG חלופי עשוי להיות נוכח במורד הזרם של קודונים להפסיק מוקדם. ניתן להשתמש ב-ATG זה כדי ליזום ביטוי חלבון, וכתוצאה מכך חלבון קטוע מתפקד חלקית. מגיב ריכוז אמצעי אחסון להוספה חלבון Cas9 במים ללא נוקלאז עם 20% גליסול 2 מיקרוגרם/מיקרו-אל 5 μL tracrRNA ב 5 mM טריס-Cl pH 7.5 4 מיקרוגרם/מיקרול 5 μL dpy-10 crRNA ב 5 mM טריס-Cl pH 7.5 8 מיקרוגרם/מיקרול 0.4 μL rbm-3.2 crRNA ב 5 mM טריס-Cl pH 7.5 8 מיקרוגרם/מיקרול 1 μL תבנית תיקון dpy-10 במים סטריליים ללא נוקלאז 500 ננוגרם/μL 0.55 μL תבנית תיקון rbm-3.2 במים סטריליים ללא נוקלאז 1 מיקרוגרם/מיקרול 2.2 μL KCl במים סטריליים ללא נוקלאז 1 מטר 0.5 μL מים סטריליים ללא נוקלאז – 5.35 μL טבלה 1: רכיבי תערובת ההזרקה לעריכת CRISPR/Cas9 באמצעות מתחמי ריבונוקליאופרוטאין ו-dpy-10 כסמן CRISPR משותף. השתמש בטכניקות סטריליות ריאגנטים ללא RNase בעת ביצוע תערובת ההזרקה. אנא שימו לב כי מים סטריליים, שאינם נטולי נוקלאז, אינם מטופלים ב- DEPC, שימשו להכנת תערובת ההזרקה. מגיב ריכוז אמצעי אחסון להוספה KCl 1 מטר 5 מ”ל טריס-HCl pH 8.3 1 מטר 1 מ”ל MgCl2 1 מטר 250 μL NP-40 (או IGEPAL CA-630) 100% 450 μL טווין-20 100% 450 μL ג’לטין 2% 500 μL מים – 92.35 מ”ל טבלה 2: מתכון חיץ תמוגה תולעת. חיץ תמוגת התולעת יכול להיעשות בתפזורת, autoclaved, מסונן aliquoted לאחסון לטווח ארוך (הערה: מאגר תמוגה ניתן לאחסן במשך למעלה משנה בטמפרטורת החדר). הוסיפו דילול של 1:100 מ”ג/מ”ל פרוטאינאז K למאגר תמוגת התולעת ממש לפני כל שימוש. איור 1: סכמטית המציגה crRNA ועיצוב תבנית תיקון עבור RBM-3.2 עצירה מוקדמת CRISPR. A. סכמטי המציג את גדילי הקידוד והתבנית של הגן rbm-3.2 עם רצף crRNA ורצף המוטיב PAM הממוקם בגדיל התבנית. B.סכמטי המייצג את המאפיינים השונים של תבנית התיקון שסותזנה כדי להכניס שלושה קודונים של עצירה מוקדמת לגן rbm-3.2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: ציר זמן ניסיוני ליצירת אלגנים בעריכת הומוזיגוס על ידי עריכת CRISPR/Cas9 באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין שהורכבו מראש ו-dpy-10 כסמן CRISPR משותף. פירוט יומיומי של השלבים שיש לבצע כדי ליצור C. elegans בעריכת הומוזיגוס בשיטה זו של עריכת CRISPR/Cas9. בקצרה, 30 תולעים הוזרקו עם תערובת העריכה CRISPR באמצעות microinjection והופרדו על לוחות MYOB בודדים זרע עם OP50 E. coli. לאחר 24 שעות, תולעי P0 המוזרקות הועברו על לוחות MYOB חדשים טריים והותר להם להמשיך להטיל ביצים. בימים 3 ו -4 לאחר microinjection, הצלחות נבדקו לנוכחות של תולעי רול F1. הלוחות עם המספר המרבי של תולעי רול ו- Dpy F1 נבחרו ותולעי 73 F1 רול (בדרך כלל אנו בוחרים בין 50 ל 100 תולעי רול F1 לניסוי CRISPR) היו מסומנים על לוחות MYOB בודדים חדשים (1 תולעת לכל צלחת) והותר להטיל ביצים במשך כ 2 ימים. ביום 6 לאחר microinjection, ליסאטים תולעת הוכנו מן תולעי F1 כי ייצר צאצאים (F2) והם נבדקו לנוכחות של העריכה על ידי PCR ואחריו הגבלת העיכול עם EcoRI ואלקטרופורזה ג’ל אגרוז. ביום 7, 12 תולעים שאינן רול, שאינן Dpy F2 הועברו מהצלחות החיוביות ללוחות בודדים חדשים והותר להם לייצר צאצאים (F3). ביום 9, תולעי F2 הוקרנו להומוזיגוזיות של העריכה כמתואר קודם לכן. ביום 10, תמוגת תולעת, PCR וניקוי PCR בוצעו עבור תולעי הומוזיגוס F3 וריכוז ה- DNA נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. ביום ה-11, תגובות רצף סנגר הוקמו עבור דגימות חיוביות והתגובות נשלחו לרצף DNA. ביום 12 נותחו תוצאות הרצף, ונוכחות העריכה אומתה באמצעות תוכנת ניתוח רצף (למשל מציג רצף CLC). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: הקרנה עבור C. elegans כי הם הטרוזיגוס עבור קודונים עצירה מוקדמת rbm-3.2. תמונות אלקטרופורזה של ג’ל אגרוז של C. elegans גנומי PCR DNA מתעכל עם EcoRI. 73 תולעי F1 בודדות היו genotyped והוקרנו לנוכחות של rbm-3.2 לערוך. מספרים אדומים ו כוכביות מצביעים על תולעים ערוכות באופן חיובי. כל 7 האלגנים שזוהו בעריכה חיובית היו הטרוזיגוס לעריכה כשהם הציגו שבר דנ”א אחד לא ערוך מסוג בר של 445 כ”ס ושני שברי DNA של 265 bp ו-166 bp בהתאמה מהעותק הערוך של הגן rbm-3.2 בעיכול EcoRI. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: זיהוי ואימות של אלגנים בעריכת הומוזיגוס הנושאים את קודוני העצירה המוקדמת של rbm-3.2. א. הקרנה עבור C. elegans כי הם הומוזיגוס עבור rbm-3.2 קודונים עצירה מוקדמת. תמונות אלקטרופורזה של ג’ל אגרוז של ה- DNA הגנומי C. elegans מתעכלות עם EcoRI. 12 תולעי F2 בודדות מלוחות חיוביים היו genotyped והוקרנו להומוזיגוסיות של rbm-3.2 לערוך. אדום: תולעים בעריכת הומוזיגוס. 6 מתוך 12 תולעי F2 המוקרנות (50%) היו הומוזיגוס עבור קודונים עצירה מוקדמת rbm-3.2. לא היה מוצר PCR עבור תולעת 7. ב. מאשר את החדרת קודונים להפסיק מוקדם ב rbm-3.2 על ידי ריצוף DNA. סכמטי המציג את ההשוואה של רצפי DNA וחלבון של הומוזיגוטים לא ערוכים וערוכים. ניתוח תוצאות ריצוף DNA של DNA גנומי מתולעים בעריכת הומוזיגוס אישר את נוכחותם של שלושת קודונים לעצור מוקדם בגן rbm-3.2 על עריכת CRISPR / Cas9. כל השינויים בחומצת האמינו הנובעים לאחר עריכת CRISPR/Cas9 מסומנים באותיות אדומות או כוכביות אדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

השתמשנו בפרוטוקול לעיל כדי לערוך מספר גנים מלבד rbm-3.2. יעילות העריכה שלנו עבור loci שונים, RNAs מדריך ותבניות תיקון (חד-גדילי ו כפול תקוע) השתנו בין 2% ל 58% (נתונים לא מוצגים). יעילות העריכה הנצפית דומה ליעילות העריכה שדווחה בעבר של 2% עד 70% עבור פרוטוקול זה²⁷. הצלחנו גם להשתמש בטכניקה זו בביצוע מחיקות גנים. באמצעות שני crRNAs החלפנו גן שאורכו קרוב ל- 6 kb ברצף הקידוד של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (נתונים שאינם מוצגים). בניסוי זה, כ -14% מהתולעים Rol F₁ שניתחו נמצאו חיוביות למחיקת הגן והחלפתן ב- GFP (נתונים שלא הוצגו). עם זאת, נדרשים ניסויים נוספים כדי לקבוע את האורך המרבי של מחיקות גנים והחלפות שניתן לבצע בטכניקה זו.

ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור הוספות באורך של כ- 1.6 kb¹⁹. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי עבור ביצוע הוספות שאורכם מעל 1.6 kb באמצעות פרוטוקול זה, יצירת שתי הפסקות גדיל כפול ושימוש בתבניות תיקון עם זרועות הומולוגיות ארוכות יותר יכול לאפשר החדרה של שברי DNA גדולים בהרבה (~ 10 Kb)²⁸. לחלופין, ניתן לבצע סבבים מרובים של עריכת גנים עם פרוטוקול זה כדי ליצור עריכות גדולות יותר. פרוטוקולים אחרים לעריכת גנים מבוססי פלסמיד C. elegans CRISPR/Cas9 עשויים להיות מאומצים גם לניסויי CRISPR הכוללים החדרת שברי DNA הגדולים מ- 1.6 kb⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸.

לפני השימוש בפרוטוקול זה לעריכת גנים, יש צורך להבטיח כי הגן של עניין אינו מקושר לוקוס dpy-10 על כרומוזום II. במקרה של גן יעד המקושר ל- dpy-10, זה עלול להיות בעייתי כדי הפרד את מוטציית dpy-10 הרחק העריכה של עניין. לפיכך, במקרה כי גן העניין מקושר לוקוס dpy-10, סמני CO-CRISPR אחרים כגון unc-58 (X-כרומוזום),unc-22 או zen-4 (כרומוזום IV), ובן-1 או pha-1 (כרומוזום III) הממוקמים על כרומוזומים שונים ניתן להשתמש²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁸. נתונים ממעבדת מאייר מראים כי מוטציות בן 1 וזן-4 יכולות לשמש כסמני CRISPR משותפים מוצלחים להקרנה בשיטה^{זו 28}. עם זאת, חשוב לציין כי שימוש בזן-4 ו-pha-1 כסמני CRISPR משותפים מחייב ביצוע ניסוי CRISPR ברקעים שאינם מסוג זן-4(cle10ts) או pha-1(e2123ts) בהתאמה ^26,²⁸. יתר על כן, ניסויי CRISPR מעורבים כמה סמני CRISPR שיתוף כגון בן 1 עשוי לדרוש הכנת לוחות מיוחדים (למשל לוחות המכילים בנזימידזול)²⁸. השתמשנו בהצלחה בסמן UNC-58 co-CRISPR כדי לסנן עבור עריכות חיוביות עבור גן המקושר ל- dpy-10 בשיטה זו (נתונים שאינם מוצגים). המוטציה unc-58(e665) מעניקה פנוטיפ גלוי (שיתוק) שניתן להשתמש בו ביעילות כדי לסנן תולעים ערוכות חיובית²⁴. לחלופין, אם גישה למיקרוסקופ פלואורסצנטי זמינה, גן GTBp-1 מתויג פלואורסצנטית יכול לשמש גם כסמן CRISPR משותף לפרוטוקול¹⁹.

עבור יעילות עריכה גבוהה בעת שימוש בשיטה זו של עריכת גנום, אתר העריכה חייב להיות בטווח של 10 עד 30 בסיסים מאתר חיתוך Cas9. אם אתר העריכה נמצא במרחק של יותר מ-30 בסיסים מאתר חיתוך Cas9, יעילות העריכה יורדת באופן דרסטי¹⁹^,³⁵^,³⁷. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה ממעבדת מאייר הראה כי יצירת שתי הפסקות גדיל כפול במרחק אחד מהשני יכול לאפשר החדרת עריכות הרחק מאתר חיתוך Cas9 באמצעות פרוטוקול זה²⁸.

בפרוטוקול הנוכחי, תבנית התיקון תוכננה כך שכל שלושת קודי העצירה שנוספו יופיעו באותה מסגרת קריאה. עם זאת, אסטרטגיה חלופית ליצירת מוטציות null תהיה להשתמש בקלטת STOP-IN אוניברסלית באורך 43 בסיסים שתוארה בעבר⁵⁰. חשוב לציין, לקלטת זו יש קודונים להפסיק בכל שלוש מסגרות הקריאה האפשריות וגורמת למוטציות של שינוי מסגרת. זוהי אסטרטגיה שימושית במיוחד ליצירת מוטציות Null כאשר מתרחש תיקון לא תקין או לא שלם באתר העריכה.

לסיכום, בשל משך הזמן הקצר וההתקדמות האחרונה בשיטה זו, זוהי שיטה מצוינת לניסויי מעבדה שגרתיים הכוללים תוספת של תגי אפיטופ אימונוגניים קצרים, תגי פלורסנט, ביצוע מחיקות גנים, החלפת גנים והחלפות קודון.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הסטארט-אפ של אוניברסיטת טולסה (TU) ומלגת הקיץ לפיתוח הפקולטה להוראה TU שהוענקה לג’יוטי אייר. ברצוננו להודות לתוכנית המחקר לתואר ראשון בכימיה (CSURP) ולאתגר המחקר לתואר ראשון בטולסה (TURC) על הענקת מלגות לסטודנטים המעורבים במחקר זה. אנחנו רוצים להודות לגברת קרוליין דאן על עזרתה הטכנית. לבסוף, ברצוננו להודות לד”ר ג’ורדן וורד, איימי ג’רמילו-למברט, אנה אלן, רוברט שיף, ויליאם פוטר וסיילי מוזה על הערותיהם הביקורתיות על כתב היד הזה.

Materials

Barcoded DNA sequencing tubes	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Premixed	N/A
Cas9 protein	PNA Bio	CP01	Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	N/A	Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
ECoRI	New England Biolabs	R3101S	Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit	Qiagen	28004	Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix	Meridian Bioscience	BIO-25043	Stored at -30 °C
Primers	IDT	N/A	Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K	Gold Bio	P-480-SL4	Stored at -30 °C
Repair template oligos	IDT	N/A	4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	U-002005-50	Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C

References

Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annual Review of Biochemistry. 83, 409-439 (2014).
Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of Programmable Nucleases for Genome Engineering. Journal of Molecular Biology. 428 (5), 963-989 (2016).
Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Almendros, C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 155 (3), 733-740 (2009).
Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. CRISPR, Methods in Molecular Biology. 1311, 7-75 (2015).
Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
Frøkjær-Jensen, C. Exciting prospects for precise engineering of Caenorhabditis elegans genomes with CRISPR/Cas9. Genetics. 195 (3), 635-642 (2013).
Waaijers, S., Boxem, M. Engineering the Caenorhabditis elegans genome with CRISPR/Cas9. Methods. 68 (3), 381-388 (2014).
Xu, S. The application of CRISPR-Cas9 genome editing in Caenorhabditis elegans. Journal of Genetics and Genomics. 42 (8), 413-421 (2015).
Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121, 86-93 (2017).
Kim, H. M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
Prior, H., MacConnachie, L., Martinez, J. L., Nicholl, G. C., Beg, A. A. A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins. Journal of Visualized Experiments. (134), e57518 (2018).
Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly efficient, rapid and Co-CRISPR-independent genome editing in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (11), 3693-3698 (2017).
Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
Arribere, J. A., Bell, R. T., Fu, B. X., Artiles, K. L., Hartman, P. S., Fire, A. Z. Efficient marker-free recovery of custom genetic modifications with CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (3), 837-846 (2014).
Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
Ward, J. D. Rapid and precise engineering of the Caenorhabditis elegans genome with lethal mutation co-conversion and inactivation of NHEJ repair. Genetics. 199 (2), 363-377 (2015).
Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
Levy, A. D., Yang, J., Kramer, J. M. Molecular and genetic analyses of the Caenorhabditis elegans dpy-2 and dpy-10 collagen genes: a variety of molecular alterations affect organismal morphology. Molecular Biology of the Cell. 4 (8), 803-817 (1993).
Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55 (4), 555-565 (1988).
Schnabel, H., Schnabel, R. An organ-specific differentiation gene, pha-1, from Caenorhabditis elegans. Science. 250 (4981), 686-688 (1990).
Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Research. 22 (9), 1762-1763 (1994).
Chalfie, M., Thomson, J. N. Structural and functional diversity in the neuronal microtubules of Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 93 (1), 15-23 (1982).
Severson, A. F., Hamill, D. R., Carter, J. C., Schumacher, J., Bowerman, B. The aurora-related kinase AIR-2 recruits ZEN-4/CeMKLP1 to the mitotic spindle at metaphase and is required for cytokinesis. Current Biology. 10 (19), 1162-1171 (2000).
Paix, A., Schmidt, H., Seydoux, G. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs. Nucleic Acids Research. 44 (15), 128 (2016).
Chiu, H., Schwartz, H. T., Antoshechkin, I., Sternberg, P. W. Transgene-free genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas. Genetics. 195 (3), 1167-1171 (2013).
Paix, A., et al. Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 Sites in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1347-1356 (2014).
Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nature Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church, G. M., Calarco, J. A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PloS One. 9 (5), e98186 (2014).
Iyer, J., DeVaul, N., Hansen, T., Nebenfuehr, B. Using microinjection to generate genetically modified Caenorhabditis elegans by CRISPR/Cas9 editing. Microinjection, Methods in Molecular Biology. 1874, 431-457 (2019).
JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
Peel, N., Iyer, J., Naik, A., Dougherty, M. P., Decker, M., O’Connell, K. F. Protein phosphatase 1 down regulates ZYG-1 levels to limit centriole duplication. PLoS Genetics. 13 (1), 1006543 (2017).
Dickinson, D. J., Pani, A. M., Heppert, J. K., Higgins, C. D., Goldstein, B. Streamlined genome engineering with a self-excising drug selection cassette. Genetics. 200 (4), 1035-1049 (2015).
Norris, A. D., Kim, H. M., Colaiácovo, M. P., Calarco, J. A. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans with a toolkit of dual-marker selection cassettes. Genetics. 201 (2), 449-458 (2015).
Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA Donor Molecules Greatly Improves Precision Genome Editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (2), (2020).
Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3607-3616 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).

Automatically Generated

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

Automatically Generated

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below