Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma

Todos os experimentos em animais foram realizados sob a licença ZH152/17 de acordo com as normas e regulamentos da Comissão de Ética Cantonal de Zurique e da instalação de animais EPIC no Instituto de Ciências da Saúde Molecular, ETH Zurique. NOTA: Este protocolo começa com a exclusão dos DMRs H19- e IG-DMRs em phaESCs. Para obter detalhes sobre como estabelecer linhas phaESC, consulte os relatórios publicados10,13. Uma visão geral e um prazo deste protocolo (etapas 1-14) são fornecidos na Figura 1A; mídia, soluções e buffers estão listados na Tabela 1. O procedimento para estabelecer linhas DKO-phaESC (etapas 1-6) é mostrado na Figura 1B, e a estratégia para a construção de embriões semi-clonados (etapas 7-14) é retratada na Figura 1C. 1. Transfecção de plasmídeos para exclusão de H19-DMR e IG-DMRem phaESCs Prepare os plasmídeos CRISPR/Cas9 para co-expressão de nucleases Cas9 e guie as RNAs para direcionar as exclusões de H19-DMR e IG-DMR. Ligate quatro pares de guia RNA oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R listado na Tabela 2) em plasmídeos pX330.NOTA: Consulte o protocolo publicado sobre o procedimento detalhado para a elaboração destes 4 plasmídeos CRISPR/Cas914. Alternativamente, os plasmídeos disponíveis para cepas gerais de mouses também são acessíveis através de um repositório (Tabela de Materiais). Cubra a superfície de um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de solução de gelatina de 0,2% por incubação a 37 °C por 10 min. Placa 2 × 105 phaESCs de tipo selvagem no poço revestido de gelatina no meio haESC sem antibióticos, e incubar a placa a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 durante 1 dia.NOTA: Os antibióticos são omitidos do meio para aumentar a eficiência da lipofecção subsequente. Usamos phaescs de tipo selvagem na passagem 10. Recomendamos o uso de phaESCs de passagem antecipada, mas uma variedade de número de passagem foi usado com sucesso8. A correlação entre o número de passagem e a eficiência da obtenção de embriões semi-clonados e camundongos atualmente não é conhecida. PhaESCs transfeito no poço de uma placa de 6 poços (a partir do passo 1.3) com 6 plasmídeos simultaneamente usando reagente de lipofecção: 50 ng piggyBac plasmid carregando um transgene CAG-EGFP, 50 ng piggyBac transposase plasmid, e 600 ng de cada um dos 4 plasmídeos CRISPR/Cas9 (a partir do passo 1.1). Consulte o protocolo do fabricante sobre o procedimento detalhado da transfecção.NOTA: Dois plasmídeos piggyBac são usados para integrar um transposon para expressão onipresente de proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) no genoma dos phaESCs. Se a marcação GFP das células não for necessária, esses dois plasmídeos podem ser substituídos por um plasmídeo CRISPR/Cas9 para expressão transitória de proteínas de fluorescência (por exemplo, pX458 plasmid) em vez de um dos plasmídeos pX330. A expressão EGFP transitória pode então ser usada para classificar células transfeinadas. Dois dias após a transfecção, aspire o meio e adicione 800 μL de trippsina. Incubar a placa a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 5 min. Em seguida, adicione 2 mL de tampão de lavagem para saciar a trippsina e pipeta várias vezes para obter uma única suspensão celular. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min, e remova o supernaspe. Resuspende a pelota celular em 400 μL de tampão de manutenção haESC complementado com 15 μg/mL Hoechst 33342.NOTA: Para reduzir a toxicidade potencial de Hoechst 33342, 1 μg/mL Hoechst 33342 e 50 μM verapamil foram usados em vez de 15 μg/mL Hoechst 3334215. Incubar a suspensão da célula a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 15 minutos. Após a incubação, transfira a suspensão celular para um tubo de 5 mL através de uma tampa de filtro celular, e mantenha o tubo a 4 °C até estar pronto para usar na próxima etapa (seção 2). 2. Revestimento unicelular de phaESCs transfectados usando um citômetro de fluxo Um dia antes de classificar os phaESCs transfectados, os fibroblastos embrionários de camundongos irradiados (MEFs) em placas de 96 poços revestidos de gelatina a uma densidade de 4 × 104 células/cm2 no meio MEF. Normalmente, 6 placas são preparadas para estabelecer uma linha phaESC com exclusões direcionadas. Incubar as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2.NOTA: Os MEFs irradiados estão disponíveis comercialmente. Usamos MEFs derivados de embriões E12,5 de camundongos DR4. Embora os haESCs possam crescer em placas revestidas de gelatina sem MEFs, recomendamos MEFs para aumentar a viabilidade de haESCs únicos ordenados. No dia da classificação, aspire o meio MEF das placas de 96 poços, e adicione 120 μL de médio haESC fresco por poço. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. Configure um classificador de células com um bico de 100 μm de acordo com as instruções do fabricante. Um laser UV de 355 nm e um laser azul de 488 nm são usados para excitação de fluorescência Hoechst 33342 e EGFP, respectivamente.NOTA: Alternativamente, hoechst 33342 pode ser detectado por excitação com 405 nm. Classifique os phaESCs transfectados no tubo de 5 mL (a partir da etapa 1.10) usando um portão para coleta de células haploides na fase G1/S que mostram a expressão EGFP. Deposite uma única célula em cada poço das placas de 96 poços a partir da etapa 2.2.NOTA: A detecção de manchas de Hoechst 33342 geralmente distingue 3 picos de células com um teor de DNA de 1n, 2n e 4n, que correspondem a células haploides na fase G1, uma mistura de células haploides na fase G2/M e células diploides na fase G1, e células diploides na fase G2/M, respectivamente. As células haploides na fase G1/S são identificadas como o pico com menor intensidade de fluorescência Hoechst 33342. Um resultado representativo e um portão de classificação são mostrados na Figura 2A. Após o emplacamento, incubar as placas de 96 poços a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%. 3. Sub-clonagem de phaESCs transfectados Três dias após o revestimento unicelular, colônias podem ser observadas em vários poços das placas de 96 poços sob um microscópio. Marque os poços em que só crescem colônias únicas.NOTA: Em nossa experiência, colônias únicas foram observadas em 20%-40% dos poços das placas de 96 poços. No dia 4, após o revestimento unicelular, substitua metade do meio por um novo meio haESC nos poços por colônias únicas. Um dia antes da passagem (no dia 4 ou 5 após o revestimento de célula única), placa irradiava MEFs em placas revestidas de gelatina de 96 poços a uma densidade de 4 × 104 células/cm2 no meio MEF. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. Após 5 ou 6 dias de revestimento unicelular, selecione poços das placas de 96 poços contendo colônias únicas com um diâmetro maior que 150 μm.NOTA: Aproximadamente 100 poços são preferencialmente selecionados para estabelecer uma linha phaESC com as exclusões de DMR direcionadas. Aspire o meio nos poços selecionados e adicione 30 μL de trippsina. Incubar as placas de 96 poços a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 5 min. Em seguida, adicione 30 μL de tampão de lavagem a cada poço para saciar a trippsina. Adicione 140 μL de meio haESC em cada poço e pipeta várias vezes para obter células únicas. Aspire o meio MEF dos poços das placas de 96 poços preparadas na etapa 3.3. Transfira os phaESCs de cada poço a partir da etapa 3.6 para um poço fresco da nova placa de 96 poços a partir da etapa 3.7. Incubar as placas de 96 poços contendo subclonas phaESC a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. No dia seguinte, aspire todo o meio de cada poço, e adicione 120 μL de novo meio haESC. Incubar as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. Um dia antes de as células se tornarem confluentes para a passagem, plaque os MEFs irradiados em placas de 24 poços revestidos de gelatina a uma densidade de 4 × 104 células/cm2 no meio MEF. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. Quando os phaESCs se tornarem confluentes para a passagem, aspire o meio e adicione 30 μL de trippsina. Incubar as placas de 96 poços a 37 °C por 5 min. Adicione 90 μL de tampão de lavagem em cada poço para saciar a trippsina. Pipeta várias vezes para obter células únicas. Aspire o meio MEF dos poços das placas de 24 poços da etapa 3.11, e adicione 600 μL de meio haESC fresco. Transfira 60 μL da suspensão de subclones phaESC de cada poço na etapa 3.13 para um novo poço das placas de 24 poços da etapa 3.14. Mantenha a suspensão restante de cada subclona phaESC para extração de DNA e genotipagem na etapa 4. Incubar as placas de 24 poços com os subclones phaESC a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. Um dia antes que as culturas celulares atinjam a densidade para a passagem, plaque os MEFs irradiados em placas de 6 poços revestidos de gelatina a uma densidade de 4 × 104 células/cm2 no meio MEF. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. Quando os phaESCs se tornarem confluentes o suficiente para a passagem, aspire o meio e adicione 250 μL de trippsina. Incubar as placas de 24 poços a 37 °C por 5 min.NOTA: Após o genotipagem na etapa 4.9, apenas as linhas phaESC com exclusões tanto do H19-DMR quanto do IG-DMR precisam ser passageadas. Adicione 750 μL de tampão de lavagem em cada poço para saciar a trippsina. Pipeta várias vezes para obter uma única suspensão celular. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min, remover o supernasciente e resuspensar a pelota da célula em 2 mL de meio haESC. Aspire o meio MEF dos poços das placas de 6 poços a partir do passo 3.17. Transfira a suspensão phaESC de cada tubo da etapa 3.20 para um novo poço. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. Expanda os clones de células repetindo as etapas 3.17 para 3.21 e aumentando o tamanho da placa e os volumes de trippsina, tampão de lavagem e meio haESC. Prepare um frasco T25 para cada linha de MEFs phaESC subspetada para a etapa 5.NOTA: Recomendamos o congelamento de uma alíquota de cada linha phaESC subs clonada em 300 μL de meio de congelamento e manter um criostock no armazenamento de nitrogênio líquido antes de prosseguir para o passo 5. 4. Primeiro genotipagem de linhas de phaESC sub clonadas com MEFs Para extrair DNA genômico da suspensão celular restante da etapa 3.15, adicione 200 μL de tampão de lise a cada poço das placas de 96 poços. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL. Enxágüe cada poço com um adicional de 200 μL de tampão de lise para recuperar todas as células restantes e coletar no mesmo tubo de 1,5 mL. Incubar o tubo de 1,5 mL a 55 °C durante 3 h com mistura. Após a incubação, adicione 460 μL de isopropanol a cada tubo de 1,5 mL e misture suavemente até que um precipitado de DNA se torne visível. Centrifugar os tubos a ≥ 10.000 x g por 5 min e remover o supernasal. Lave as pelotas de DNA com 200 μL de 70% de etanol. Centrifugar os tubos a ≥ 10.000 x g por 5 min e remover o supernasal. Seque os tubos no ar por 10 minutos e depois resuspenque o DNA em 20 μL de água. Realize a reação em cadeia de polimerase (PCR) usando polimerase de DNA termoestável seguindo o protocolo do fabricante.NOTA: Os pares de primer para PCR estão listados na Tabela 2 e são usados da seguinte forma: H19-DMR-P1 e P3 (407 bp para H19-DMR excluído); H19-DMR-P2 e P3 (623 bp para wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 e P3 (319 bp para IG-DMR excluído); IG-DMR-P2 e P3 (492 bp para wildtype IG-DMR). O perfil de temperatura do PCR para todos os pares de primer é o seguinte: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. O comprimento dos fragmentos de DNA amplificados para as exclusões H19-DMRe IG-DMRmostra alguma variação devido à união final não homólogo associada à edição mediada pelo CRISPR/Cas9. Os PhaESCs foram cultivados com MEFs, que contêm DNA wildtype H19-DMR e IG-DMR. Portanto, os pares de primer de H19-DMR-P2/P3 e IG-DMR-P2/P3, que amplificam fragmentos de DNA do tipo selvagem, não são informativos. No entanto, esses pares de primer são incluídos como controles e devem dar uma banda em todas as reações. Analise os fragmentos de PCR por eletroforese de gel agarose. Consulte o protocolo publicado sobre o procedimento detalhado da eletroforese16. Identifique linhas celulares com exclusões tanto de H19-DMR quanto IG-DMR. Uma imagem representativa da eletroforese é mostrada na Figura 2B.NOTA: No nosso caso, oito linhas de células com exclusões tanto de H19-DMR quanto de IG-DMRforam identificadas entre 135 linhas phaESC subs clonadas. 5. Purificação de células haploides de linhas phaESC subs clonadas Quando as culturas phaESC sub clonadas nos frascos T25 do passo 3.22 se tornarem densas o suficiente para a passagem, aspire o meio e adicione 1,5 mL de trippsina. Incubar o frasco a 37 °C por 5 min. Em seguida, adicione 4,5 mL de tampão de lavagem e pipeta várias vezes para obter uma suspensão unicelular. Transfira cada suspensão celular para um tubo de 15 mL e centrífugue o tubo a 160 x g por 5 min. Remova o supernasciente e resuspenque as pelotas celulares em 400 μL de tampão de manutenção haESC complementado com 15 μg/mL Hoechst 33342. Incubar as suspensões celulares a 37 °C por 15 min. Após a incubação, transfira as suspensões celulares para um tubo de 5 mL através de uma tampa de filtro celular. Enxágüe a tampa do coador celular com um adicional de 400 μL de tampão de manutenção haESC e colete as células restantes no mesmo tubo de 5 mL. Mantenha o tubo a 4 °C até ficar pronto para classificar. Configure um citómetro de fluxo com um bocal de 100 μm de acordo com as instruções do fabricante.NOTA: Hoechst 33342 pode ser detectado por excitação a 405 nm. Aqui, um laser UV de 355 nm é usado para detecção de Hoechst 33342. Configure a suspensão celular (a partir da etapa 5.3) e um novo tubo de 15 mL contendo 2 mL de tampão de manutenção haESC para coletar células classificadas no citómetro de fluxo. Inicie a análise e configure o portão de classificação para coletar células haploides na fase G1/S. Consulte o histograma na Figura 2A para identificar a população da fase G1/S da PHAESC.NOTA: Algumas linhas de phaESC subs clonadas podem não conter células haploides por causa da diploidização completa ou plating errôneo de células diploides na etapa 2. Se as células haploides não forem observadas na fase G1/S, proceda para outra amostra sem classificação. No nosso caso, 5 linhas de células continham células haploides e 3 linhas celulares continham apenas células diploides de 8 linhas de phaESC subs clonadas. Após a triagem celular, adicione 5 mL de tampão de lavagem ao longo da parede do tubo de coleta de 15 mL. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min. Remova o supernatante. Selecione uma placa de tamanho adequado para cultivo, dependendo do número de células classificadas. Use um único poço de uma placa de 96 poços, uma placa de 24 poços, e uma placa de 12 poços para cultivar 1.000-40.000 células, 40.000-200.000 células, e 200.000-400.000 células, respectivamente. Resuspenque a pelota celular em 120 μL, 600 μL e 1,2 mL de média haESC, respectivamente.NOTA: As células em alta densidade porque a baixa confluência pode causar a morte celular das células após a triagem. A partir deste ponto, os phaESCs são cultivados em poços revestidos de gelatina sem MEFs para facilitar o genotipagem na etapa 6 e a aplicação subsequente para injeção intracytoplasmática a partir do passo 9. Depois de transferir a suspensão celular para um poço revestido de gelatina do tamanho apropriado, incubar a placa a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%. Continue expandindo as culturas phaESC repetindo passos 3.18 para 3.21 com o aumento do tamanho das placas e aumentando os volumes de trippsina, tampão de lavagem e meio haESC. As células são cultivadas em poços revestidos de gelatina sem MEFs. Para cada linha phaESC subs clonada, prepare uma cultura em um poço de uma placa de 24 poços e um poço de uma placa de 6 poços para as etapas 6 e 9, respectivamente.NOTA: Algumas células de cada linha phaESC subs clonada devem ser congeladas em 300 μL de meio de congelamento como criostock em um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido antes de prosseguir para o passo 9. 6. Segundo genotipagem de linhas de phaESC sub clonadas sem MEFs NOTA: Uma segunda rodada de genotipagem é realizada para confirmar que as linhas phaESC sub clonadas possuem exclusões tanto dos H19- quanto de IG-DMRs, e que alelos do tipo selvagem estão ausentes após a remoção de MEFs. Confirme sob o microscópio que as culturas em poços das placas de 24 poços da etapa 5.11 estão livres de MEFs.NOTA: Se os MEFs forem observados, é necessário continuar a passar as culturas até que os MEFs tenham desaparecido para evitar contaminar o PCR com DNA de tipo selvagem de MEFs. Aspire o meio a partir de culturas confluentes e adicione 400 μL de tampão de lise por poço da placa de 24 poços. Depois de pipetting várias vezes, transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL. Incubar o tubo de 1,5 mL a 55 °C durante 3 h com mistura. Após a incubação, adicione 400 μL de isopropanol ao tubo de 1,5 mL e misture suavemente até que um precipitado de DNA se torne visível. Centrifugar o tubo a ≥ 10.000 x g por 5 min e remova o supernasal. Lave a pelota de DNA com 200 μL de 70% de etanol. Centrifugar o tubo a ≥ 10.000 x g por 5 min e remova o supernasal. Seque o tubo no ar por 10 minutos e depois resuspenque o DNA em 50 μL de água. Realize o PCR genotipagem seguindo o passo 4.7 e eletroforese de gel na etapa 4.8 para identificar linhas celulares, que possuem exclusões tanto do H19- quanto do IG-DMRs e estão livres de alelos do tipo selvagem.NOTA: Uma imagem de uma análise típica de segundo genotipagem é mostrada na Figura 2B para referência. No nosso caso, todas as 5 linhas celulares selecionadas após a purificação de células haploides (etapa 5) estavam livres de alelos wildtype e possuíam apenas os alelos de exclusão dos H19- e IG-DMRs. Use as linhas phaESC subs clonadas selecionadas após esta segunda genotipagem como linhas DKO-phaESC. 7. Superovulação de ratos Para a produção de oócitos MII, inicie a superovulação por injeção intraperitoneal de 5 UI de solução de égua grávida gonadotropina (PMSG) em cada rato fêmea B6D2F1 (4-5 semanas) 63-65 h antes da coleta de oócito.NOTA: A cepa do mouse B6D2F1 é recomendada para este protocolo porque os oócitos B6D2F1 toleram bem a injeção intracytoplasmática e mostram alto potencial de desenvolvimento após o procedimento17. Quarenta e oito horas após a injeção de PMSG, injete intraperitoneally 5 UI de solução de gonadotropina coriônica humana em cada rato. 8. Coleção Oócito Prepare uma placa de 4 poços contendo 700 μL de meio de hialuronidase em um poço e 700 μL de m2 médio nos 3 poços restantes. Além disso, prepare um prato de 6 cm com 7 mL de m2 médio e um prato de centro-poço com 900 μL de m16 médio. Pré-aqueça o prato e os pratos a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. No dia da injeção intracytoplasmática, eutanize as fêmeas superovuladas (a partir do passo 7.2) por deslocamento cervical ou inalação de CO2 por volta das 8h da manhã. Disseque os ovidutos usando pinças e tesouras. Coloque os ovidutos no prato de 6 cm com meio M2. Solte os complexos cumulus-oocyte (COCs) rasgando a ampola dos oviducts com uma agulha de 30 G. Transfira os COCs para o meio de hialuronidase pré-aquecido e mantenha a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%. Após 2-3 min, colete oócitos sem cumulus com uma pipeta bucal e lave os oócitos 3 vezes transferindo-os para o meio M2 fresco nos outros 3 poços da placa de 4 poços. Coletar oócitos metafase II (MII), que possuem os primeiros corpos polares, em um prato de centro-poço com meio M16 e manter a placa a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% até ser usada para injeção intracytoplasmática na etapa 12. 9. Tratamento e coleta de DKO-phaESCs Prepare uma cultura DKO-phaESC em um poço de uma placa de 6 poços sem MEFs a 60-80% de confluência um dia antes da injeção intracytoplasmática (a partir do passo 5.11). Para induzir a detenção do ciclo celular em fase M, aspire o meio completamente e adicione 2 mL de meio haESC contendo 0,05 mg/mL demecolcina. Após 8h de tratamento demecolcina, aspire o meio e adicione 800 μL de trippsina. Incubar a placa a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 5 min, depois adicione 2 mL de tampão de lavagem para saciar a trippsina e pipeta várias vezes para obter uma suspensão unicelular. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min e remover o supernaspe. Resuspenque a pelota de célula em 400 μL de tampão de manutenção haESC contendo 15 μg/mL Hoechst 33342. Incubar a suspensão da célula a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 15 minutos. Após a incubação, transfira a suspensão celular para um tubo de 5 mL através de uma tampa de filtro celular, e mantenha o tubo a 4 °C até a classificação celular na etapa 10. 10. Purificação de DKO-phaESCs presos em fase M Configure um citómetro de fluxo com um bocal de 100 μm de acordo com as instruções do fabricante.NOTA: Hoechst 33342 pode ser detectado por excitação a 405 nm. Aqui, um laser UV de 355 nm é usado para detecção de Hoechst 33342. Configure os DKO-phaESCs presos em fase M a partir da etapa 9.7 e inicie a análise. Selecione um portão de classificação adequado para coletar as células de fase M haploide (2n) da amostra tratada com demecolcina.NOTA: Após o tratamento da demecolcina, são esperadas 2 populações de células, correspondendo às células haploides e diploides de prisão em fase M, conforme mostrado na Figura 3B. A parada do ciclo celular após o tratamento da demecolcina está completa, portanto, não é observado pico de DNA haploide 1n. Isso é importante, pois as células de fase M haploide e células diploides G1 possuem o mesmo conteúdo de DNA (2n) e produziriam picos sobrepostos. Configure um tubo de 15 mL contendo 2 mL de tampão de manutenção haESC para coletar as células classificadas no citômetro de fluxo. Comece a classificar as células. Após a triagem celular, adicione 5 mL de tampão de lavagem ao longo da parede do tubo de coleta. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min e remover o supernaspe. Resuspenque as células em um volume apropriado de tampão de manutenção haESC para obter uma concentração final de 5 x 105 células/mL. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL. Mantenha o tubo no gelo até ficar pronto para injeção intracytoplasmática na etapa 12. 11. Preparação de pipetas de retenção e microinjeção NOTA: Para a realização da injeção intracytoplasmática (etapa 12), são necessárias várias pipetas de retenção e microinjeção(Figura 4A). Estas pipetas podem ser compradas sob demanda sob medida de um fornecedor comercial ou feitas de capilares de vidro adequados usando um puxador de micropipette e uma microforge. Puxe capilares de vidro borossilicato em um puxador de micropipette. Para puxar capilares de vidro borossilicato sem filamento (0,78 x 1,00 x 80 mm) os seguintes parâmetros são dados para um puxador horizontal flamejante(Tabela de Materiais) como referência, mas diferem para outros instrumentos e tipos capilares de vidro: Calor 510 (Teste de rampa 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 e Pressure 200 para segurar pipetas; Heat 510 (Teste de rampa 480), Pull 90, Velocity 140, Time 125 e Pressure 200 para pipetas de microinjeção.NOTA: Os parâmetros ideais precisam ser definidos individualmente porque vários fatores, incluindo a umidade, o modelo de um puxador de micropipette e o lote dos capilares de vidro podem afetar a forma das pipetas de injeção. Uma forma alongada com um taper gradual deve ser destinada. Preparação de pipetas de retenção Definir um capilar puxado preparado na etapa 11.1 para um microforge. Coloque o capilar sobre a conta de vidro no filamento e baixe o capilar para fazer um contato com a conta de vidro enquanto aquece o filamento. Quebre o capilar desligando o aquecimento e se desprendendo da conta de vidro de tal forma que seu diâmetro externo seja de 60-100 μm. Posicione a ponta capilar horizontalmente para enfrentar a conta de vidro no filamento. Aqueça o filamento para permitir que o diâmetro interno da ponta capilar derreta até um diâmetro de 10-20 μm. Mova o capilar para que a conta de vidro se posiciona a um ponto ~1 mm da ponta capilar sem contato. Aqueça o filamento para permitir que o capilar dobre em um ângulo de 20°. Desmonte o capilar, chamado de pipeta de retenção, do microforge.NOTA: Para medir o tamanho do capilar, uma ântice de ocular é preferencialmente instalada no microforge. Preparação de pipetas de microinjeção Definir um capilar puxado preparado na etapa 11.1 para um microforge. Coloque o capilar sobre a conta de vidro no filamento e baixe o capilar para fazer um contato com a conta de vidro enquanto aquece o filamento. Quebre o capilar desligando o aquecimento e se destacando da conta de vidro em uma posição que seu diâmetro externo é de 6 μm. Mova o capilar para que a conta de vidro se posiciona a um ponto ~1 mm da ponta capilar sem contato. Aqueça o filamento para permitir que o capilar dobre para cima em um ângulo de 20°. Desmonte a pipeta de microinjeção do microforge e armazene em uma caixa segura para uso posterior.NOTA: As pipetas de microinjeção são preparadas com as seguintes especificações: diâmetro externo, 6 μm; diâmetro interno, 4,5-5 μm; ângulo de dobra, 20°. Definir o design ideal da pipeta de microinjeção é importante para o sucesso da injeção intracytoplasmática. Um diâmetro interno muito grande pode impedir a ruptura da membrana plasmática dos DKO-phESCs doadores (ver seção de discussão). Se o diâmetro interno for muito estreito, pode impedir a pipetação suave dos DKO-phESCs doadores. Um ângulo de dobra < 30° é preferível, pois um ângulo de curva alta impede o efeito dos pulsos piezo. 12. Injeção intracytoplasmática de DKO-phaESCs Antes da injeção intracytoplasmática (a partir da etapa 12.2), prepare uma solução de polivinillpyrrolidone (PVP) adicionando 5 mL de m2 médio em um tubo de 50 mL contendo 0,6 g de PVP e agitando o tubo em um roqueiro a 4 °C por 2 dias. Depois que o PVP se dissolveu completamente, a solução é filtrada estéril e armazenada a 4 °C. No dia da injeção intracytoplasmática, prepare um prato de centro-poço com 900 μL de meio KSOM e pré-aqueça o prato a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%. Prepare um prato de micromanipulação alinhando gotas de 5 μL de solução PVP e 20 μL de m2 médio em uma tampa de um prato de 10 cm que é colocado de cabeça para baixo. Cubra as gotas com óleo mineral e coloque o prato no palco do microscópio de injeção.NOTA: O arranjo recomendado do prato de micromanipulação é mostrado na Figura 4B. Instale uma pipeta de retenção no micromanipulador. Encha a pipeta de microinjeção com o óleo de fluorocarbono usando uma ponta de microcarregador e monte-a no atuador piezo. Mergulhe a pipeta de microinjeção em uma gota com solução PVP e pipeta para cima e para baixo várias vezes para revestir o vidro com PVP e torná-lo menos pegajoso. Carregue um pequeno volume de solução PVP na pipeta de microinjeção e mova a pipeta para uma gota com meio M2. Mergulhe a pipeta de retenção no meio M2 e foque na pipeta na parte inferior da gota. Transfira aproximadamente 2 μL de suspensão DKO-phaESC da etapa 10.6 para a queda média M2. Transfira 10 oócitos MII da etapa 8.5 para a mesma gota média M2 usando uma pipeta bucal. Para injeção, gire um oócito na gota média M2 para que o espaço perivitelline fique de frente para a pipeta de microinjeção, e a placa MII não esteja localizada no caminho da pipeta de microinjeção(Figura 4A). Segure o oócito aplicando pressão negativa através da pipeta de retenção.NOTA: Uma placa MII é visualmente identificada como uma saliência de ooplasma que é referida como uma “corcunda” e muitas vezes localizada ao lado do primeiro corpo polar. A placa MII contém o eixo meiotic com cromossomos conectados. O toque da pipeta de microinjeção e da placa MII deve ser evitado, pois danos mecânicos do fuso e cromossomos podem interromper o desenvolvimento de embriões. Carregue um DKO-phaESC na ponta da pipeta de microinjeção aplicando pressão negativa suave. Ruptura da membrana plasmática de um DKO-phaESC por pipetação para evitar a injeção de um DKO-phaESC intacto(Figura 3C; ver discussão).NOTA: No caso de a membrana plasmática de um DKO-phaESC não ser rompida por pipetação, descarte o DKO-phaESC e carregue outro DKO-phaESC. Coloque a pipeta de microinjeção em contato com a zona pellucida do oócito, e aplique uma pequena quantidade de pressão negativa dentro da pipeta de microinjeção. Aplique impulsos piezo (intensidade, 20; frequência, 4) para romper a zona enquanto empurra a ponta da pipeta de microinjeção em direção ao espaço perivitelline. Confirme que a placa MII, contendo um fuso e cromossomos, não está localizada no caminho da pipeta de microinjeção.NOTA: Ajuste empiricamente a configuração aos pulsos piezo mais baixos para perfuração através da zona para minimizar a possibilidade de danos ao oolemma. Descarte o fragmento da zona pellucida da pipeta de microinjeção e posicione o DKO-phaESC na borda da pipeta. Penetre o oócito com a pipeta de microinjeção para que o oolemma chegue ao lado oposto.NOTA: Não toque na placa MII para evitar danos ao fuso e aos cromossomos. Aplique um pulso piezo (intensidade, 6; frequência, 1) para perfurar o oolemma. Certifique-se de que o oolemma relaxe ao longo do eixo da pipeta de microinjeção.NOTA: Defina empiricamente o ajuste mais baixo do pulso piezo para quebrar o oolemma para minimizar os danos ao oócito. Injete o DKO-phaESC com um volume mínimo de meio no ooplasma e retire a pipeta de microinjeção suavemente do oócito. Solte o oócito injetado da pipeta de retenção e coloque-o na lateral da microdrop para coleta posterior. Repita o procedimento de injeção das etapas 12.9 às 12:17 para os outros oócitos MII na queda média M2.NOTA: Evite manter os oócitos fora da incubadora por mais de 20 minutos. Em nossa experiência, um lote de 10 oócitos pode ser manipulado confortavelmente dentro de 15 minutos após o treinamento adequado. Transfira o lote de oócitos injetados da gota média M2 para um prato de centro-poço pré-aquecido com meio KSOM. Mantenha o prato por 1h a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. Repita a manipulação de oócitos das etapas 12.5 e 12.20 com grupos adicionais de oócitos MII para obter oócitos injetados suficientes. 13. Ativação de embriões semi-clonados construídos Prepare dois pratos de centro-poço com 900 μL cada um do meio KSOM e meio de ativação. Prepare uma placa de 4 poços com 700 μL de meio KSOM em cada poço. Pré-aqueça os pratos e o prato a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. Após 1 h no meio KSOM, transfira os oócitos injetados da etapa 12.21 para o prato de centro-poço pré-aquecido com meio de ativação. Mantenha o prato por 6h a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% para ativação. Após a ativação, observe alguns embriões semi-clonados formam três corpos polares, que são o primeiro e o segundo corpos polares do oócito, e o corpo pseudo polar do DKO-phaESC(Figura 3E). Lave os embriões 3 vezes transferindo-os para novos poços com meio KSOM em uma placa de 4 poços. Transfira os embriões para o prato central-bem com meio KSOM, e mantenha o prato a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% para maior desenvolvimento. 14. Desenvolvimento de embriões semi-clonados construídos Após 1 dia de cultura no meio KSOM a partir da etapa 13.6, vários embriões semi-clonados atingem o estágio de 2 células(Figura 5A). Para o desenvolvimento adicional de embriões de pré-implantação in vitro, continue a culminar os embriões semi-clonados no meio KSOM a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%. Transfira os embriões semi-clonados para o meio KSOM fresco no dia 2. No dia 4, vários embriões chegarão ao estágio blastocisto(Figura 5A). Para a derivação de camundongos semi-clonados, transfira embriões de 2 células da etapa 14.1 para os ovidutos de fêmeas pseudo-grávidas. Identifique fêmeas pseudo-grávidas acasalando em machos vasectomizados um dia antes da transferência do embrião e selecione-as com base na presença de um plugue claramente visível na manhã do dia para a transferência do embrião (0,5 dias pós-coitum (dpc)). Em torno de 19,5 dpc, os filhotes de termo são naturalmente entregues de fêmeas receptoras(Figura 5B).