マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

すべての動物実験は、チューリッヒ州倫理委員会の基準と規制と、ETHチューリッヒ分子保健科学研究所のEPIC動物施設の基準と規制に従って、ライセンスZH152/17の下で行われました。 注: このプロトコルは、PhaESC のH19およびIG-DDR の削除から始まります。phaESCラインの設定方法の詳細については、公表されたレポート10,13を参照してください。このプロトコルの概要と時間枠 (手順 1 ~ 14) は図 1Aに示されています。メディア、ソリューション、およびバッファを表 1に示します。DKO-phaESCラインを確立する手順(ステップ1~6)を図1Bに示し、半クローン胚の構築戦略(ステップ7~14)を図1Cに示します。 1. PhaESCにおける H19-DMRおよび IG-DMRの欠失のためのプラスミドのトランスフェクション Cas9ヌクレアーゼの共発現のためのCRISPR/Cas9プラスミドを調製し 、H19-DMRおよび IG-DMRの欠失を標的とするRNAを導く。ガイドRNAオリゴの4組をリゲート (H19-DMR-gRNA1-F, R;H19-DMR-gRNA2-F, R;IG-DMR-gRNA1-F, R;IG-DMR-gRNA2-F, R) を pX330 プラスミドに表 2)に記載した。注: これら 4 CRISPR/Cas9 プラスミド14の準備のための詳細な手順に公開されているプロトコルを参照してください。あるいは、一般的なマウス株に利用できるプラスミドもリポジトリ(資料表)を通じてアクセスできます。 10分間37°Cでインキュベーションして、1 mLの0.2%ゼラチン溶液で6ウェルプレートの1ウェルの表面をコーティングします。 プレート2×105の野生型ファESCをゼラチンコーティングした高い抗生物質を含まないHAESC培地で、37°Cで5%CO2雰囲気中で1日間インキュベートする。注:抗生物質は、その後のリポフェクションの効率を高めるために培地から省略されます。我々は、通路10で野生型phaESCを使用した。我々は、早期通過ファESCを使用することをお勧めしますが、様々な通路番号が正常に使用されています8.半クローン胚とマウスを得る通過数と効率との間の相関は現在知られていない。 6ウェルプレート(ステップ1.3から)のウェル内のトランスフェックを、リポフェクション試薬を同時に使用して6個のプラスミドを使用する:50 ng ピギーバツ プラスミドは、CAG-EGFPトランスジーン、50ng ピギーバツ トランスポザーゼプラスミド、および4R/CAS9プラスミド(ステップ1.1.1.1.1から)のそれぞれ600 ngを運ぶ。トランスフェクションの詳細な手順については、製造元のプロトコルを参照してください。注:2つの ピギーバツ プラスミドは、強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の遍在発現のためのトランスポゾンをファセスクのゲノムに統合するために使用されます。細胞のGFPマーキングが必要でない場合、これら2つのプラスミドは、pX330プラスミドの1つではなく、蛍光タンパク質(例えばpX458プラスミド)の一過性発現のためにCRISPR/Cas9プラスミドによって置換することができる。一時的なEGFP発現は、トランスフェクトされた細胞を選別するために使用することができます。 トランスフェクションの2日後、培地を吸引し、800μLのトリプシンを加える。 5%CO2雰囲気で37°Cで5分間インキュベートします。次いで、2mLの洗浄バッファーを加えてトリプシンをクエンチし、ピペットを数回加えて、単一の細胞懸濁液を得た。 細胞懸濁液を15mLチューブに移します。 チューブを160xgで5分間遠心し、上清を取り除く。 15 μg/mL Hoechst 33342 を補った haESC メンテナンスバッファーの 400 μL でセルペレットを再懸濁します。注意:Hoechst 33342の潜在的な毒性を減らすために、1 μg/mLのHoechst 33342および50 μMのベラパミルは15 μg/mLのHoechst 33342 3334215の代わりに使用されていた。 細胞懸濁液を37°Cで5%CO2雰囲気中で15分間インキュベートします。インキュベーション後、セルストレーナーキャップを通して細胞懸濁液を5mLチューブに移し、次のステップで使用できる状態になるまでチューブを4°Cに保ちます(セクション2)。 フローサイトメーターを用いたトランスフェクトphaESCの単細胞めっき トランスフェクトされたphaESCを選別する前の1日前に、プレートは、MEF培地中の4×104細胞/cm2の密度でゼラチンコーティング96ウェルプレートにマウス胚性線維芽細胞(MEF)を照射した。典型的には、6つのプレートは、標的削除を伴うphaESCラインを確立するために準備される。37°Cのプレートを5%CO2雰囲気でインキュベートします。注: 照射された MEF は市販されています。DR4マウスのE12.5胚由来のMEFを用いた。HAESCはMEFなしでゼラチンコーティングされたプレートで成長することができますが、ソートされた単一のHAESCの生存率を高めるためMEFをお勧めします。 選別の日に、MEF培地を96ウェルプレートから吸引し、1ウェルあたり120μLの新鮮なHAESC培地を加えます。プレートを37°Cに保ち、5%CO2の雰囲気を保ちます。 メーカーの指示に従って100 μmノズルを備えたセルソーターを設置します。355 nmの紫外線レーザーおよび488 nm青のレーザーはそれぞれHoechst 33342およびEGFP蛍光の励起のために使用される。注: または、Hoechst 33342 は 405 nm の励起によって検出できます。 EGFP発現を示すG1/S相でハプロイド細胞を収集するためのゲートを用いて、5mLチューブ内のトランスフェースファESCを(ステップ1.10から)並べ替えます。ステップ2.2から96ウェルプレートの各ウェルに単一のセルを堆積させます。注:Hoechst 33342染色の検出は、一般的に、G1相のハプロイド細胞、G1相のハプロイド細胞およびG1相のジプロイド細胞、およびG2/M相のジプロイド細胞の混合物である1n、2n、および4n DNA含有量を有する細胞の3つのピークを区別する。G1/S相のハプロイド細胞は、蛍光ヘヒスト33342の低強度のピークとして同定される。代表的な結果とソートゲートを 図2Aに示します。 めっきした後、37°Cの96ウェルプレートを5%CO2雰囲気でインキュベートします。 3. トランスフェクトフェースのサブクローニング 単細胞めっきの3日後、96ウェルプレートのいくつかのウェルでコロニーを顕微鏡で観察することができる。単一のコロニーだけが成長する井戸に印を付けます。注:私たちの経験では、単一のコロニーは96ウェルプレートの井戸の20%〜40%で観察されました。 単一細胞めっき後4日目に、培地の半分を単一コロニーでウェル内の新しいHAESC培地に置き換えます。 合格の1日前(単一細胞めっき後4日目または5日目)、プレートはMEF培地中の4×104細胞/cm2の密度でゼラチンコーティング96ウェルプレートにMEFを照射した。プレートを37°Cに保ち、5%CO2の雰囲気を保ちます。 5日または6日間の単細胞めっきの後、直径が150μmを超える単一コロニーを含む96ウェルプレートのウェルを選択します。注:約100のウェルが好ましくは、ターゲットDMRの削除とphaESCラインを確立するために選択されます。 選択したウェルに培地を吸引し、30 μLのトリプシンを加えます。96ウェルプレートを37°Cで5%CO2雰囲気で5分間インキュベートします。その後、各ウェルに30μLの洗浄バッファーを加え、トリプシンを急がれます。 各ウェルに140μLのhaESC培地を加え、ピペットを数回加えて単一細胞を得る。 ステップ3.3で調製した96ウェルプレートのウェルからMEF培地を吸引する。 ステップ3.6から各井戸からphaESCをステップ3.7から新しい96ウェルプレートの新鮮な井戸に移します。 PHAESCサブクローンを含む96ウェルプレートを37°Cで5%CO2雰囲気でインキュベートします。 翌日、各ウェルからすべての培地を吸引し、120μLの新しいHAESC培地を加えます。37°Cのプレートを5%CO2雰囲気でインキュベートします。 細胞が通過のためにコンフルエントになる前日に、照射したMEFをGEF培地中の4×10個の4細胞/cm2の密度でゼラチンコーティングされた24ウェルプレートにプレートします。プレートを37°Cに保ち、5%CO2の雰囲気を保ちます。 phaESCがパスエージングのコンフルエントになった場合は、培地を吸引し、30 μLのトリプシンを加えます。96ウェルプレートを37°Cで5分間インキュベートします。 各ウェルに90μLの洗浄バッファーを加え、トリプシンを急がれます。ピペットは、単一細胞を得るために数回。 ステップ3.11から24ウェルプレートのウェルからMEF培地を吸引し、600μLの新鮮なHAESC培地を加えます。 ステップ3.13の各ウェルからphaESCサブクローンの懸濁液の60 μLをステップ3.14から24ウェルプレートの新しいウェルに移します。ステップ4でDNA抽出および遺伝子型入力のために各phaESCサブクローンの残りの懸濁液を保持する。 24ウェルプレートを37°CのphaESCサブクローンで5%CO2雰囲気でインキュベートします。 細胞培養物が通過密度に達する前日に、被照射したMEFをMEF培地中の4×4個の4細胞/cm2の密度でゼラチンコーティング6ウェルプレートにプレートします。プレートを37°Cに保ち、5%CO2の雰囲気を保ちます。 phaESCが通過するのに十分なコンフルエントになると、培地を吸引し、250 μLのトリプシンを加えます。24ウェルプレートを37°Cで5分間インキュベートします。注: ステップ 4.9 でのジェノタイピングの後 、H19-DMR と IG-DMR の両方を削除した phaESC ラインのみを継ぎ継ぐ必要があります。 各ウェルに750 μLの洗浄バッファーを加え、トリプシンを急いでクエンチします。ピペットを数回回して、単一の細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を15mLチューブに移します。 チューブを160xgで5分間遠心し、上清を取り除き、2mLのhaESC培地で細胞ペレットを再懸濁する。 ステップ3.17から6ウェルプレートのウェルからMEF培地を吸引する。ステップ3.20から各チューブからphaESC懸濁液を新しいウェルに移します。プレートを37°Cに保ち、5%CO2の雰囲気を保ちます。 ステップ3.17~3.21を繰り返し、プレートサイズとトリプシン、洗浄バッファー、およびHAESC培地の量を増やして、細胞クローンを拡大します。ステップ5のMEFのサブクローニングphaESCラインごとにT25フラスコを準備します。注:我々は、ステップ5に進む前に、300 μLの凍結培地で各クローン化phaESCラインのアリコートを凍結し、液体窒素貯蔵中のクライオストックを保持することをお勧めします。 4. MEFを使用したサブクローンPHAESCラインの最初のジェノタイピング ステップ3.15から残りの細胞懸濁液からゲノムDNAを抽出するには、96ウェルプレートの各ウェルに200 μLのリシスバッファーを加えます。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。さらに200 μLのライシスバッファーで各ウェルをリンスし、残りのすべての細胞を回収し、同じ1.5 mLチューブに集めます。 混合で3時間55°Cで1.5 mLチューブをインキュベートします。 インキュベーション後、各1.5 mLチューブに460μLのイソプロパノールを加え、DNA沈殿が見えるまで穏やかに混ぜます。 5分間≥10,000 x g でチューブを遠心分離し、上清を取り除く。DNAペレットを200μLの70%エタノールで洗浄します。 5分間≥10,000 x g でチューブを遠心分離し、上清を取り除く。 チューブを空気中で10分間乾燥させ、20μLの水で再懸濁します。 製造者のプロトコルに従って、耐熱性DNAポリメラーゼを使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行います。注: PCR 用のプライマー ペアは表 2にリストされており、H19-DMR-P1 および P3 (削除されたH19-DMR の場合は 407 bp) として使用されます。H19-DMR-P2 および P3 (野生型H19-DMR の場合は 623 bp)。IG-DMR-P1 および P3 (削除されたIG-DMR の場合は 319 bp)。IG-DMR-P2 および P3 (野生型IG-DMR の場合は 492 bp)。全プライマー対のPCRの温度プロファイルは以下の通りです:30 s 98°C、35 x(10 s 98°C、20 s 56°C、30 s 72°C)、5分72°C。 H19-DMRおよびIG-DMR欠失のための増幅されたDNA断片の長さは、CRISPR/Cas9媒介編集に関連する非相同末端結合のために、いくつかの変動を示す。PhaESCは、野生型H19-DMRおよびIG-DMR DNAを含むMEFで培養した。したがって、野生型DNA断片を増幅するH19-DMR-P2/P3とIG-DMR-P2/P3のプライマー対は有益ではない。 しかし、これらのプライマーペアはコントロールとして含まれており、すべての反応でバンドを与える必要があります。 アガロースゲル電気泳動によりPCR断片を解析します。電気泳動16の詳細な手順に関する公開プロトコルを参照してください。 H19-DMRおよびIG-DMR の両方の欠失を持つ細胞株を識別します。電気泳動の代表的な画像を図2Bに示します。注: 我々の場合 、H19-DMRおよび IG-DMRの両方の欠失を有する 8 つの細胞株は 135 サブクローン phaESC ラインの間で識別された。 5. サブクローニングphaESCラインのハプロイド細胞浄化 ステップ3.22からT25フラスコ中のクローン化phaESC培養物が通過するのに十分な密度になると、培地を吸引し、1.5mLのトリプシンを加える。フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。次いで、4.5mLの洗浄バッファーとピペットを数回加え、単一細胞懸濁液を得る。 各細胞懸濁液を15mLチューブに移し、チューブを160 x g で5分間遠心分離します。上清を取り外し、15 μg/mL Hoechst 33342を補ったhaESCメンテナンスバッファーの400 μLの細胞ペレットを再懸濁します。 37°Cで細胞懸濁液を15分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞懸濁液を細胞ストレーナーキャップを通して5mLチューブに移します。さらに400 μLのhaESC維持バッファーで細胞ストレーナーキャップをリンスし、残りの細胞を同じ5 mLチューブに集めます。チューブは、並べ替えの準備ができるまで4°Cに保ちます。 メーカーの指示に従って、100 μmノズルでフローサイトメーターを設置します。注意: Hoechst 33342は405 nmで励起によって検出することができる。ここでは、355nmのUVレーザーがHoechst 33342の検出に使用される。 細胞懸濁液(ステップ5.3から)と2 mLのhaESCメンテナンスバッファを含む新しい15 mLチューブを設定し、フローサイトメーターでソートされた細胞を収集します。 解析を開始し、G1/S フェーズでハプロイドセルを収集するソートゲートを設定します。G1/S相phaESC集団を同定するための 図2A のヒストグラムを参照して下さい。注:一部のサブクローニングphaESCラインは、ステップ2で完全な二量化または誤った二量体細胞のメッキのためにハプロイド細胞を含まないかもしれません。G1/S相でハプロイド細胞が観察されない場合は、並べ替えなしで別のサンプルに進みます。我々の場合、5つの細胞株にはハプロイド細胞が含まれ、3つの細胞株は8つのクローン化されたphaESCラインのうちジプロイド細胞しか含まれなかった。 細胞選別後、15 mLのコレクションチューブの壁に沿って5mLの洗浄バッファーを加えます。チューブを160 x g で5分間遠心します。上清を取り除く。 選別された細胞の数に応じて、培養に適したサイズのプレートを選択します。96 ウェル プレート、24 ウェル プレート、12 ウェル プレートを使用して、それぞれ 1,000 ~ 40,000 細胞、40,000 ~ 200,000 細胞、200,000 ~ 400,000 細胞を培養します。細胞ペレットを120μL、600μL、1.2mLのhaESC培地で再懸濁します。注: コンフルエンスが低いと、並べ替え後に細胞の細胞死を引き起こす可能性があるため、セルを高密度にプレートします。この時点以降、phaESCは、ステップ6でのジェノタイピングを容易にし、ステップ9からその後の細胞質注入の適用を容易にするために、MEFのないゼラチンコーティングされた井戸上で培養される。 細胞懸濁液を適当なサイズのゼラチンコーティングウェルに移した後、5%CO2雰囲気中で37°Cでプレートをインキュベートする。 プレートサイズを増加させ、トリプシン、洗浄バッファー、およびHAESC培地の量を増やすことでステップ3.18〜3.21を繰り返すことでphaESC培養を拡大し続けます。細胞は、MEFなしでゼラチンコーティングされた井戸上で培養される。 各クローン化phaESCラインごとに、ステップ6と9の24ウェルプレートと6ウェルプレートの1つのウェルに培養を準備します。注:各クローン化phaESCラインの一部の細胞は、ステップ9に進む前に、液体窒素貯蔵タンク内の凍結培地の300 μLで凍結する必要があります。 6. MEFを含まないサブクローンphaESCラインの第2のジェノタイピング 注:2回目のジェノタイピングが行われ、サブクローニングされたphaESCラインが H19と IG-DDRの両方の削除を持ち、MEFの除去後に野生型対立遺伝子が存在することを確認します。 ステップ5.11から24ウェルプレートの井戸の培養物がMEFから自由であることを顕微鏡で確認してください。注: MEF が観察された場合、MEF から野生型 DNA を使用して PCR を汚染しないように、MEF が消失するまで培養物の通過を継続する必要があります。 コンフルエント培養から培地を吸引し、24ウェルプレートのウェルあたり400 μLのリシスバッファーを加えます。数回ピペット処理した後、細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。 混合で3時間55°Cで1.5 mLチューブをインキュベートします。 インキュベーション後、イソプロパノールを400μLのチューブに加え、DNA沈殿が見えるまで穏やかに混ぜます。 チューブを10,000 x g≥5 分間遠心し、上清を取り除く。DNAペレットを200μLの70%エタノールで洗浄します。 チューブを10,000 x g≥5 分間遠心し、上清を取り除く。 チューブを空気中で10分間乾燥させ、50μLの水で再懸濁します。 ステップ4.7に続く遺伝子型変換PCRとステップ4.8のゲル電気泳動を行い、H19とIG-DDRの両方の欠失を有し、野生型対立遺伝子を含まない細胞株を同定します。注: 参考用の図 2Bに、典型的な 2 番目のジェノタイピング分析のイメージを示します。我々の場合、ハプロイド細胞精製後に選択された5個の細胞株(ステップ5)はすべて、野生型対立遺伝子から解放され、H19およびIG-DDRの欠失対立遺伝子のみを有していた。 この2回目のジェノタイピングの後に選択されたサブクローニングphaESCラインをDKO-phaESCラインとして使用してください。 7. マウスのスーパー排卵 MII卵母細胞の製造のために、妊娠したマレ血清性ゴナドトロピン(PMSG)溶液の5 IUの腹腔内注射による超排卵を各B6D2F1雌マウス(生後4~5週齢)63~65時間前に卵母細胞コレクションに開始する。注:B6D2F1卵母細胞は、細胞内皮注入を十分に許容し、手順17の後に高い発達可能性を示すので、B6D2F1マウス株は、このプロトコルに推奨されます。 PMSG注射後48時間、腹腔内にヒト絨毛性ゴナドトロピン溶液の5IUを各マウスに注入する。 8. 卵母細胞コレクション 700 μLのヒアルロニダーゼ培地を1ウェルに、M2培地を残りの3ウェルに700 μL用意します。さらに、M2培地7 mLの6cm皿とM16培地900μLのセンターウェルディッシュを用意します。5%CO2雰囲気の中で37°Cでプレートと料理を予熱します。 細胞内挿注射の日に、子宮頸部脱臼またはCO2 吸入のいずれかによって、朝の午前8時頃に超排卵した女性(ステップ7.2から)を安楽死させる。ピンセットとハサミを使って卵管を解剖する。6cm皿にオビダクトをM2培地で入れます。 30G針で卵管のアンフェッラを引き裂くことによって、cumulus-oocyte複合体(COC)を放出する。コマを温め込んだヒアルロンダーゼ培地に移し、37°Cで5%のCO2 雰囲気に保ちます。 2~3分後、口のピペットでcumulusフリーの卵母細胞を収集し、4ウェルプレートの他の3つのウェルで新鮮なM2培地に移して卵母細胞を3回洗います。 第1極体を保有する分母II(MII)卵母細胞をM16培地付きのセンターウェル皿に集め、ステップ12で細胞内皮質注入に使用するまでプレートを5%CO2雰囲気に保ち、37°Cでプレートを5%CO2雰囲気に保ちます。 9. DKO-ファエスクの治療と収集 DKO-phaESC培養を、細胞内質注入の前日に60~80%の合流率でMEFのない6ウェルプレートのウェルで準備します(ステップ5.11から)。 M相で細胞周期停止を誘導するために、培地を完全に吸引し、0.05mg/mLデメコルシンを含むhaESC培地2mLを添加する。 8時間のデメコルシン処理後、培地を吸引し、800μLのトリプシンを加える。 5%CO2雰囲気の中で37°Cのプレートを5分間インキュベートし、2mLの洗浄バッファーを加えてトリプシンをクエンチし、ピペットを数回加えて単一細胞懸濁液を得る。 細胞懸濁液を15mLチューブに移します。チューブを160 x g で5分間遠心し、上清を取り除く。 15 μg/mL Hoechst 33342 を含む haESC メンテナンスバッファーの 400 μL でセルペレットを再懸濁します。 細胞懸濁液を37°Cで5%CO2雰囲気中で15分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞懸濁液を細胞ストレーナーキャップを通して5mLチューブに移し、ステップ10で細胞が選別されるまで4°Cでチューブを保持する。 10. M相逮捕DKO-phaESCの浄化 メーカーの指示に従って、100 μmノズルでフローサイトメーターを設置します。注意: Hoechst 33342は405 nmで励起によって検出することができる。ここでは、355nmのUVレーザーがHoechst 33342の検出に使用される。 ステップ 9.7 から M フェーズで逮捕された DKO-phesC をセットアップし、分析を開始します。デメコルシンで処理したサンプルからハプロイドM相細胞(2n)を採取するための適切な選別ゲートを選択する。注: デメコルシン処理後、 図 3Bに示すように、2 つの細胞集団が予測され、ハプロイドおよびジプロイド M 相逮捕細胞に対応します。デメコルシン処理が完了した後の細胞周期停止は、従って、ハプロイド1nDNAピークは認められない。これは、ハプロイドM相細胞とジプロイドG1細胞が同じDNA含有量(2n)を有し、重なり合うピークを生成するので重要である。 2 mLのhaESCメンテナンスバッファを含む15 mLチューブを設置し、フローサイトメーター内のソートされたセルを収集します。セルの並べ替えを開始します。 細胞の選別後、コレクションチューブの壁に沿って5mLの洗浄バッファーを加えます。チューブを160 x g で5分間遠心し、上清を取り除く。 適切な量のhaESC維持バッファー内の細胞を再中断して、5 x 105 細胞/mL の最終濃度を得る。 細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。ステップ12で細胞質注入の準備ができるまでチューブを氷の上に置いておきなさい。 11. 保持およびマイクロインジェクションピペットの調製 注:細胞内質注入(ステップ12)を行う場合、いくつかの保持およびマイクロインジェクションピペットが必要です(図4A)。これらのピペットは、商業サプライヤーからのオーダーメイドの需要に応じて購入するか、マイクロピペットプーラーとマイクロフォージを使用して適切なガラス毛細血管から作ることができます。 マイクロピペットの引き手にホウケイ酸ガラスの毛細血管を引っ張ります。フィラメントなしのホウケイ酸ガラス毛細血管(0.78 x 1.00 x 80 mm)を引っ張る場合は、フラミング水平引き手(材料表)に対して次のパラメータが与えられますが、他の機器やガラスキャピラリータイプでは異なります:Heat 510(ランプテスト480)、プル0、ベロシティ150、時間175、圧力200熱510(ランプ試験480)、プル90、速度140、時間125およびマイクロインジェクションピペットのための圧力200。注: 湿度、マイクロピペットプーラーのモデル、ガラス毛細血管の多くを含むいくつかの要因が注入ピペットの形状に影響を与える可能性があるため、最適なパラメータを個別に定義する必要があります。段階的なテーパーを持つ細長い形状を目指すべきです。 ピペットの保持の準備 ステップ11.1で調製した1本の引っ張られた毛細管をマイクロフォージにセットする。フィラメントの上にガラスビーズの上にキャピラリーを置き、フィラメントを加熱しながらガラスビーズと接触させるためにキャピラリーを下げます。 ガラスビーズの外側の直径が 60 ~ 100 μm になるように、加熱をオフにして、ガラスビーズから取り外してキャピラリーを壊します。 毛細管先端をフィラメント上のガラスビーズに向けて水平に配置します。 フィラメントを加熱して、キャピラリーチップの内径を直径10~20μmまで溶かします。 ガラスビーズが接触せずにキャピラリー先端から1mmの位置になるようにキャピラリーを動かします。フィラメントを加熱して、毛細管を 20° の角度で曲げるようにします。毛細管を取り外し、マイクロフォージから保持ピペットと呼ぶ。注:毛細管のサイズを測定するために、接眼用レチクルが好ましくはマイクロフォージに設置される。 マイクロインジェクションピペットの調製 ステップ11.1で調製した1本の引っ張られた毛細管をマイクロフォージにセットする。フィラメントの上にガラスビーズの上にキャピラリーを置き、フィラメントを加熱しながらガラスビーズと接触させるためにキャピラリーを下げます。 暖房をオフにしてキャピラリーを破り、外径が6μmの位置でガラスビーズから取り外します。 ガラスビーズが接触せずにキャピラリー先端から1mmの位置になるようにキャピラリーを動かします。フィラメントを加熱して、毛細管を 20° の角度で上向きに曲げられるようにします。マイクロフォージからマイクロインジェクションピペットを取り外し、後で使用するために安全な箱に保管してください。注意:マイクロインジェクションピペットは、外径、6 μmの仕様で用意されています。内径、4.5~5μm;曲げ角度、20°。マイクロインジェクションピペットの最適な設計を定義することは、細胞内質注入の成功にとって重要である。内径が大きすぎると、ドナーDKO-phESCの原形質膜の破裂を防ぐことができます(説明セクションを参照)。内径が狭すぎると、ドナーDKO-phESCの滑らかなピペット化を妨げる可能性があります。曲げ角度<30°は、高ベンド角度がピエゾパルスの効果を妨げるので好ましい。 12. DKO-phaESCの細胞内注入 イントラストトープラズム注射(ステップ12.2から)に先立ち、0.6 gのPVPを含む50 mLチューブにM2培地5mLを加え、4°Cのロッカーでチューブを2日間攪拌することにより、ポリビニルピロリドン(PVP)溶液を調製します。PVPが完全に溶解した後、溶液は滅菌濾過され、4°Cで保存されます。 細胞内質注入の日に、KSOM培地の900 μLとセンターウェル皿を準備し、5%CO2雰囲気の中で37°Cで皿を予熱する。 逆さまに置かれた10cm皿の蓋に5μLのPVP溶液と20μLのM2媒体の滴を合わせることによってマイクロマニシング皿を準備する。ミネラルオイルで滴を覆い、注入顕微鏡のステージに皿を置きます。メモ: マイクロマニピュレーションディッシュの推奨配置を 図 4Bに示します。 マイクロマニピュレーターに保持ピペットを取り付けます。マイクロローダーチップを使用してフルオロカーボンオイルをマイクロインジェクションピペットに充填し、ピエゾアクチュエータに取り付けます。 PVP溶液とピペットを数回滴下してマイクロインジェクションピペットを浸し、ガラスにPVPをコーティングし、粘着性を減らします。少量のPVP溶液をマイクロインジェクションピペットに積み込み、M2培地でピペットをドロップに移動します。 M2培地に保持ピペットを浸し、ドロップの底部のピペットに焦点を当てます。 ステップ10.6からM2培地ドロップに約2μLのDKO-phaESCサスペンションを移します。 口のピペットを使用して、ステップ8.5から同じM2培地ドロップに10 MII卵母細胞を移します。 注入の場合、M2培地ドロップで卵母細胞を回転させて、ペリビテリン空間がマイクロインジェクションピペットに面するようにし、MIIプレートがマイクロインジェクションピペットの経路に位置していないようにします(図4A)。保持ピペットを通して負圧を加えて卵母細胞を保持します。注: MII プレートは、目視で「こぶ」と呼ばれる、最初の極性体の隣に位置する、卵子の突起として識別されます。MIIプレートには、染色体が付いたメオティックスピンドルが含まれています。マイクロインジェクションピペットとMIIプレートの接触は、スピンドルおよび染色体の機械的損傷が胚の発達を妨げ得る可能性があるとして避けなければならない。 穏やかな陰圧を加え、マイクロインジェクションピペットの先端に1つのDKO-phaESCをセットします。無傷のDKO-phaESCの注入を避けるためにピペット処理によってDKO-phaESCの原形質膜を破裂させる(図3C;議論参照)。注:DKO-phaESCの原形質膜がピペットによって破裂しない場合は、DKO-phaESCを捨てて、別のDKO-phaESCをロードしてください。 卵母細胞の透明帯に接触してマイクロインジェクションピペットを置き、マイクロインジェクションピペット内に少量の負圧を加えます。 ピエゾインパルス(強度、20;周波数、4)を適用して、マイクロインジェクションピペットの先端を周回空間に向かって押しながらゾナを突破します。スピンドルと染色体を含むMIIプレートがマイクロインジェクションピペットの経路に存在しないことを確認します。注:経験的に、オゾン層を掘削するための最も低いピエゾパルスに設定を調整して、オオレンマへの損傷の可能性を最小限に抑えます。 マイクロインジェクションピペットから透明帯の断片を捨て、ピペットの端にDKO-phaESCを配置します。 ウーレンマが反対側に到達するように、マイクロインジェクションピペットで卵母細胞を貫通します。メモ:スピンドルや染色体の損傷を防ぐためにMIIプレートに触れないでください。 ピエゾパルス(強度、6;周波数、1)を適用して、オーレンマを突き刺します。オオレンマがマイクロインジェクションピペットのシャフトに沿ってリラックスすることを確認します。注:卵母細胞への損傷を最小限に抑えるために、ウーレンマを壊すためにピエゾパルスの最も低い設定を経験的に定義します。 DKO-phaESCを最小量の培地を卵卵子に注入し、卵母細胞からマイクロインジェクションピペットを滑らかに引き出します。 注入した卵母細胞を保持ピペットから放出し、後のコレクションのためにマイクロドロップの側面に置きます。 M2中液落下の他のMII卵母細胞について、ステップ12.9から12.17までの注入手順を繰り返します。注:卵母細胞を20分以上保育器から締め出さないようにしてください。私たちの経験では、10個の卵母細胞のバッチは、適切なトレーニングの後、15分以内に快適に操作することができます。 注入した卵母細胞のバッチをM2培地ドロップからKSOM培地で事前に温めたセンターウェル皿に移します。 37°Cで1時間、5%CO2雰囲気で保存します。 MII卵母細胞の追加グループでステップ12.5と12.20の卵母細胞操作を繰り返し、十分な注入卵母細胞を得る。 13. 構築された半クローン胚の活性化 KSOM培地と活性化培地のそれぞれ900 μLで2つのセンターウェルディッシュを準備します。各ウェルに700 μLのKSOM培地を入した4ウェルプレートを準備します。5%CO2 雰囲気で37°Cで予熱したお皿。 KSOM培地で1時間後、注入した卵母細胞をステップ12.21から活性化培地付きの事前温めたセンターウェル皿に移す。 活性化のために5%CO2雰囲気で37°Cで6時間の皿を保ちます。 活性化後、半クローン化された胚が3つの極体を形成し、卵母細胞の第1および第2極体、およびDKO-phaESCからの擬似極体を観察する(図3E)。 4ウェルプレートでKSOM培地で新しいウェルに移して胚を3回洗浄します。 胚をKSOM培地でセンターウェル皿に移し、さらに発達するために5%CO2雰囲気中の37°Cで皿を保つ。 14. 構築された半クローン胚の開発 ステップ13.6からKSOM培地で1日目培養した後、いくつかの半クローン胚が2細胞段階に到達する(図5A)。 インビトロでの着床前胚のさらなる発達のために、5%CO2雰囲気中で37°CのKSOM培地で半クローン胚を培養し続ける。半クローン胚を2日目に新しいKSOM培地に移します。4日目には、いくつかの胚が胚盤胞期に達する(図5A)。 半クローンマウスの誘導のために、2細胞胚をステップ14.1から疑似妊娠レシピエント女性の卵管に移す。胚移植の前日に精管切除された男性に交配して疑似妊娠女性を特定し、胚移植のために1日の朝にはっきりと見えるプラグの存在に基づいてそれらを選択する(0.5日後のコイタム(dpc))。約 19.5 dpc, 完全な期間の子犬は、受信者の女性から自然に配信されます (図 5B).