Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con la licenza ZH152/17 in conformità con gli standard e i regolamenti della Commissione etica cantonale di Zurigo e della struttura animale EPIC presso l’Istituto di scienze della salute molecolare, Zurigo del 1° Zurigo. NOTA: questo protocollo inizia con l’eliminazione dei DLF H19 e IGnei FASI. Per informazioni dettagliate su come stabilire le righe phaESC, fare riferimento alle relazionipubblicate 10,13. Una panoramica e un intervallo di tempo di questo protocollo (passaggi da 1 a 14) sono forniti nella figura 1A; i supporti, le soluzioni e i buffer sono elencati nella tabella 1. La procedura per stabilire le linee DKO-phaESC (passaggi da 1 a 6) è illustrata nella figura 1Be la strategia per la costruzione di embrioni semi-clonati (passaggi da 7 a 14) è illustrata nella figura 1C. 1. Trasfezione di plasmidi per la cancellazione di H19-DMR e IG-DMR nei faSESC Preparare i plasmidi CRISPR/Cas9 per la coespressioni delle nucleasi Cas9 e guidare gli RNA per indirizzare le decezioni di H19-DMR e IG-DMR. Ligate quattro coppie di oligo di RNA guida (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R elencato nella tabella 2) in pX330 plasmidi.NOTA: Fare riferimento al protocollo pubblicato sulla procedura dettagliata per la preparazione di questi 4 plasmidi CRISPR/Cas914. In alternativa, i plasmidi disponibili per ceppi generali di topi sono accessibili anche attraverso un repository (Table of Materials). Rivestire la superficie di un pozzo di una piastra a 6 pozze con 1 mL di soluzione di gelatina allo 0,2% per incubazione a 37 °C per 10 min. La piastra 2 × 105 faESC di tipo selvatico sul pozzo rivestito di gelatina in mezzo eSE senza antibiotici e incubare la piastra a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5% per 1 giorno.NOTA: Gli antibiotici vengono omessi dal mezzo per aumentare l’efficienza della successiva lipofezione. Abbiamo usato i faESC di tipo selvatico al passaggio 10. Si consiglia di utilizzare i faESC a passaggio precoce, ma una varietà di numeri di passaggio sono stati utilizzati con successo8. La correlazione tra il numero di passaggio e l’efficienza di ottenere embrioni e topi semi-clonati non è attualmente nota. Transfette phaESC nel pozzo di una piastra a 6 pozzetti (dal passaggio 1.3) con 6 plasmidi contemporaneamente usando il reagente di lipofezione: 50 ng piggyBac plasmide che trasporta un transgene CAG-EGFP, 50 ng piggyBac trasposasi plasmide e 600 ng di ciascuno dei 4 plasmidi CRISPR / Cas9 (dal passo 1.1). Fare riferimento al protocollo del produttore sulla procedura dettagliata della trasfezione.NOTA: Due plasmidi piggyBac sono utilizzati per integrare un transposon per l’espressione onnipresente della proteina fluorescente verde migliorata (EGFP) nel genoma dei feSC. Se la marcatura GFP delle cellule non è richiesta, questi due plasmidi possono essere sostituiti da un plasmide CRISPR/Cas9 per l’espressione transitoria delle proteine della fluorescenza (ad esempio, pX458 plasmide) invece di uno dei plasmidi pX330. L’espressione EGFP transitoria può quindi essere utilizzata per ordinare le celle trasfette. Due giorni dopo la trasfezione, aspirare il mezzo e aggiungere 800 μL di tripina. Incubare la piastra a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5% per 5 minuti. Quindi, aggiungere 2 mL di tampone di lavaggio per temprare la tripina e pipettare più volte per ottenere una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Centrifugare il tubo a 160 x g per 5 minuti e rimuovere il supernatante. Rimescolare il pellet cellulare in 400 μL di tampone di manutenzione haESC integrato con 15 μg/mL Hoechst 33342.NOTA: Per ridurre la tossicità potenziale della Hoechst 33342, sono stati utilizzati 1 μg/mL Hoechst 33342 e 50 μM verapamil invece di 15 μg/mL Hoechst 3334215. Incubare la sospensione cellulare a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5% per 15 minuti. Dopo l’incubazione, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 5 ml attraverso un tappo del filtro cellulare e mantenere il tubo a 4 °C fino a quando non è pronto per l’uso nella fase successiva (sezione 2). 2. Placcatura a cella singola di fasci trasfettati utilizzando un citometro a flusso Un giorno prima di smistare i FESC trasfetturati, i fibroblasti embrionali di topo irradiati a piastre (MEF) irradiati su piastre a 96 pozzetti rivestiti di gelatina ad una densità di 4 ×10 4 cellule/cm2 nel mezzo MEF. In genere, 6 piastre sono preparate per stabilire una linea phaESC con eliminazioni mirate. Incubare le piastre a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%.NOTA: I MEF irradiati sono disponibili in commercio. Utilizziamo MEF derivati da embrioni E12.5 di topi DR4. Sebbene gli eSIC possano crescere su piastre rivestite di gelatina senza MEF, raccomandiamo i MEF per aumentare la vitalità dei singoli ESCS ordinati. Il giorno dello smistamento, aspirare il mezzo MEF dalle piastre da 96 poggia e aggiungere 120 μL di mezzo fresco haESC per pozzo. Mantenere le piastre a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5%. Impostare uno smistatore di celle con un ugello da 100 μm secondo le istruzioni del produttore. Un laser UV a 355 nm e un laser blu a 488 nm sono utilizzati per l’eccitazione della fluorescenza Hoechst 33342 ed EGFP, rispettivamente.NOTA: In alternativa, Hoechst 33342 può essere rilevato per eccitazione con 405 nm. Ordinare i feSC trasfettati nel tubo da 5 ml (dal passaggio 1.10) utilizzando un cancello per la raccolta di cellule aploidi nella fase G1/S che mostrano l’espressione EGFP. Depositare una singola cella in ogni pozzo delle piastre a 96 potte dal passo 2.2.NOTA: Il rilevamento della colorazione Hoechst 33342 distingue generalmente 3 picchi di cellule con un contenuto di DNA 1n, 2n e 4n, che corrispondono rispettivamente alle cellule aploidi in fase G1, una miscela di cellule aploidi in fase G2/M e cellule diploidi in fase G1 e cellule diploidi in fase G2/M. Le cellule aploidi in fase G1/S sono identificate come il picco con minore intensità di fluorescenza hoechst 33342. Un risultato rappresentativo e un cancello di smistamento sono riportati nella figura 2A. Dopo la placcatura, incubare le piastre a 96 po ‘a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5%. 3. Sottoclonazione di faESC trasfette Tre giorni dopo la placcatura a una cellula, le colonie possono essere osservate in diversi pozzi delle piastre a 96 pozzi al microscopio. Segna i pozzi in cui crescono solo singole colonie.NOTA: Secondo la nostra esperienza, singole colonie sono state osservate nel 20%-40% dei pozzi delle piastre a 96 pozzi. Il giorno 4 dopo la placcatura a cella singola, sostituire metà del mezzo con un nuovo mezzo haESC nei pozzi con singole colonie. Un giorno prima della passatura (al giorno 4 o 5 dopo la placcatura a singola cellula), i MEF irradiati a piastre di gelatina rivestite con 96 possedimento ad una densità di 4 ×10 4 celle/cm2 in mezzo MEF. Mantenere le piastre a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5%. Dopo 5 o 6 giorni di placcatura a cella singola, selezionare i pozzi delle piastre a 96 potte contenenti singole colonie con un diametro superiore a 150 μm.NOTA: Circa 100 pozzi sono preferibilmente selezionati per stabilire una linea phaESC con le eliminazioni DMR mirate. Aspirare il mezzo nei pozzatti selezionati e aggiungere 30 μL di tripina. Incubare le piastre da 96 pozzetti a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5% per 5 minuti. Quindi, aggiungere 30 μL di tampone di lavaggio a ciascun pozzo per temprare la tripina. Aggiungere 140 μL di mezzo haESC in ogni pozzo e pipettare più volte per ottenere singole cellule. Aspirare il mezzo MEF dai pozzi delle piastre da 96 pozzi preparate al passaggio 3.3. Trasferire i faESC da ogni pozzo dal passaggio 3.6 in un pozzo fresco della nuova piastra da 96 pozze dal passo 3.7. Incubare le piastre da 96 potte contenenti subcloni phaESC a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%. Il giorno successivo, aspirare tutto il mezzo da ogni pozzo e aggiungere 120 μL di nuovo mezzo haESC. Incubare le piastre a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%. Un giorno prima che le cellule diventino confluenti per la passatura, placcare i MEF irradiati su piastre a 24 possedimento rivestite di gelatina ad una densità di 4 × 104 celle/cm2 in mezzo MEF. Mantenere le piastre a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5%. Quando i faESC sono diventati confluenti per il passaging, aspirare il mezzo e aggiungere 30 μL di tripina. Incubare le piastre da 96 pozzi a 37 °C per 5 minuti. Aggiungere 90 μL di tampone di lavaggio in ogni pozzo per temprare la tripina. Pipetta più volte per ottenere singole celle. Aspirare il mezzo MEF dai pozzi delle piastre a 24 pozza dal passo 3.11 e aggiungere 600 μL di mezzo fresco haESC. Trasferire 60 μL della sospensione dei subcloni phaESC da ogni pozzo nel passaggio 3.13 in un nuovo pozzo delle piastre a 24 pozza dal passo 3.14. Mantenere la sospensione rimanente di ogni subclone phaESC per l’estrazione e la genotipizzazione del DNA nella fase 4. Incubare le piastre a 24 po ‘con i subcloni phaESC a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%. Un giorno prima che le colture cellulari raggiungano la densità di passaging, placcare i MEF irradiati su piastre a 6 porci rivestite di gelatina ad una densità di 4 × 104 celle/cm2 in mezzo MEF. Mantenere le piastre a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5%. Quando i faESC diventano abbastanza confluenti per il passaging, aspirare il mezzo e aggiungere 250 μL di tripina. Incubare le piastre a 24 pozzi a 37 °C per 5 minuti.NOTA: Dopo il genotipizzazione nel passaggio 4.9, è necessario passare solo le righe phaESC con eliminazioni sia dell’H19-DMR che dell’IG-DMR. Aggiungere 750 μL di tampone di lavaggio in ogni pozzo per temprare la tripina. Pipetta più volte per ottenere una singola sospensione cellulare. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Centrifugare il tubo a 160 x g per 5 minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 2 ml di mezzo eSESC. Aspirare il mezzo MEF dai pozzi delle piastre a 6 pozzi dal passo 3.17. Trasferire la sospensione phaESC da ogni tubo dal passo 3.20 in un nuovo pozzo. Mantenere le piastre a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5%. Espandere i cloni cellulari ripetendo i passaggi da 3.17 a 3.21 e aumentando le dimensioni della piastra e i volumi di tripina, buffer di lavaggio e mezzo haESC. Preparare un pallone T25 per ogni riga di MEF phaESC sotto-clonata per il passaggio 5.NOTA: Si consiglia di congelare un’aliquota di ogni linea phaESC sub-clonata in 300 μL di mezzo di congelamento e di mantenere un criostock in conservazione di azoto liquido prima di procedere al passaggio 5. 4. Primo genotipizzazione di linee phaESC sotto-clonate con MEF Per estrarre il DNA genomico dalla sospensione cellulare rimanente dal passaggio 3.15, aggiungere 200 μL di tampone di lysis ad ogni pozzo delle piastre a 96 potte. Trasferire la sospensione cellulare su un tubo da 1,5 ml. Risciacquare ogni bene con un ulteriore tampone di lisi di 200 μL per recuperare tutte le cellule rimanenti e raccogliere nello stesso tubo da 1,5 ml. Incubare il tubo da 1,5 ml a 55 °C per 3 ore con miscelazione. Dopo l’incubazione, aggiungere 460 μL di isopropanolo a ciascun tubo da 1,5 ml e mescolare delicatamente fino a quando un precipitato di DNA diventa visibile. Centrifugare i tubi a ≥ 10.000 x g per 5 minuti e rimuovere il supernatante. Lavare i pellet di DNA con 200 μL di 70% di etanolo. Centrifugare i tubi a ≥ 10.000 x g per 5 minuti e rimuovere il supernatante. Asciugare i tubi nell’aria per 10 minuti e quindi rimorsi il DNA in 20 μL di acqua. Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando la DNA polimerasi termostabile seguendo il protocollo del produttore.NOTA: Le coppie di primer per PCR sono elencate nella tabella 2 e sono utilizzate come segue: H19-DMR-P1 e P3 (407 bp per H19-DMR eliminato); H19-DMR-P2 e P3 (623 bp per wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 e P3 (319 bp per IG-DMR cancellato); IG-DMR-P2 e P3 (492 bp per wildtype IG-DMR). Il profilo di temperatura della PCR per tutte le coppie di primer è il seguente: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. La lunghezza dei frammenti di DNA amplificati per le deezioni H19-DMR e IG-DMR mostra alcune variazioni a causa dell’unione finale non omologa associata all’editing mediato da CRISPR / Cas9. I FESC sono stati coltivati con MEF, che contengono DNA di tipo selvatico H19-DMR e IG-DMR. Pertanto, le coppie primer di H19-DMR-P2/P3 e IG-DMR-P2/P3, che amplificano frammenti di DNA di tipo selvatico, non sono informative. Tuttavia, queste coppie di primer sono incluse come controlli e dovrebbero dare una banda in tutte le reazioni. Analizzare i frammenti pcr per elettroforesi del gel di agarosio. Fare riferimento al protocollo pubblicato sulla procedura dettagliata dell’elettroforesi16. Identificare le linee cellulari con eliminazioni di H19-DMR e IG-DMR. Un’immagine rappresentativa dell’elettroforesi è mostrata nella figura 2B.NOTA: Nel nostro caso, sono state identificate otto linee cellulari con cancellazioni di H19-DMR e IG-DMR tra 135 linee phaESC sotto-clonate. 5. Purificazione delle cellule aploidi delle linee phaESC sub-clonate Quando le colture phaESC sotto-clonate nei contenitori T25 del passaggio 3.22 diventano abbastanza dense da essere passate, aspirate il mezzo e aggiungete 1,5 mL di tripside. Incubare il pallone a 37 °C per 5 minuti. Quindi, aggiungere più volte 4,5 mL di tampone di lavaggio e pipetta per ottenere una sospensione a cella singola. Trasferire ogni sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e centrifugare il tubo a 160 x g per 5 minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 400 μL di tampone di manutenzione haESC integrato con 15 μg/mL Hoechst 33342. Incubare le sospensioni cellulari a 37 °C per 15 min. Dopo l’incubazione, trasferire le sospensioni cellulari in un tubo da 5 ml attraverso un tappo del filtro cellulare. Risciacquare il tappo del filtro cellulare con altri 400 μL di tampone di manutenzione haESC e raccogliere le celle rimanenti nello stesso tubo da 5 ml. Mantenere il tubo a 4 °C fino a quando non è pronto per l’ordinamento. Impostare un citometro di flusso con un ugello da 100 μm secondo le istruzioni del produttore.NOTA: Hoechst 33342 può essere rilevato per eccitazione a 405 nm. Qui, un laser UV a 355 nm viene utilizzato per il rilevamento di Hoechst 33342. Impostare la sospensione cellulare (dal passaggio 5.3) e un nuovo tubo da 15 ml contenente 2 ml di tampone di manutenzione haESC per raccogliere le cellule ordinate nel citometro di flusso. Avviare l’analisi e impostare il cancello di smistamento per raccogliere le cellule aploidi nella fase G1/S. Fare riferimento all’istogramma della figura 2A per identificare la popolazione della fase G1/S.NOTA: Alcune linee phaESC sotto-clonate potrebbero non contenere cellule aploidi a causa della diploidizzazione completa o della placcatura errata delle cellule diploidi nel passaggio 2. Se le cellule aploidi non si osservano nella fase G1/S, procedere a un altro campione senza smistamento. Nel nostro caso, 5 linee cellulari contenevano cellule aploidi e 3 linee cellulari contenevano solo cellule diploidi su 8 linee phaESC sotto-clonate. Dopo lo smistamento delle celle, aggiungere 5 ml di tampone di lavaggio lungo la parete del tubo di raccolta da 15 ml. Centrifugare il tubo a 160 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante. Selezionare una lastra di dimensioni adeguate per la ristrutturazione a seconda del numero di celle ordinate. Usa un singolo pozzo di una piastra da 96 po’ , una piastra da 24 po’ e una piastra da 12 po’ per coltura rispettivamente 1.000-40.000 celle, 40.000-200.000 cellule e 200.000-400.000 cellule. Rimescolare il pellet cellulare rispettivamente in 120 μL, 600 μL e 1,2 mL di mezzo haESC.NOTA: Placcare le cellule ad alta densità perché una bassa confluenza può causare la morte cellulare delle cellule dopo lo smistamento. Da questo momento in poi, i feSC vengono coltivati su pozzi rivestiti di gelatina senza MEF per facilitare la genotipizzazione nella fase 6 e la successiva applicazione per l’iniezione intracitoplasmatica dal passaggio 9. Dopo aver trasferito la sospensione cellulare in un pozzo rivestito di gelatina delle dimensioni appropriate, incubare la piastra a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%. Continuare ad espandere le colture phaESC ripetendo i passaggi da 3.18 a 3.21 con l’aumento delle dimensioni delle lastre e l’aumento dei volumi di tripina, tampone di lavaggio e mezzo haESC. Le cellule sono coltivate su pozzi rivestiti di gelatina senza MEF. Per ogni linea phaESC sotto-clonata, preparare una coltura in un pozzo di una piastra da 24 po ‘e un pozzo di una piastra a 6 poggia-poggia per i passaggi 6 e 9, rispettivamente.NOTA: Alcune cellule di ciascuna linea phaESC sub-clonata devono essere congelate in 300 μL di mezzo di congelamento come criostock in un serbatoio di stoccaggio dell’azoto liquido prima di procedere al passaggio 9. 6. Seconda genotipizzazione di linee phaESC sottodolonate senza MEF NOTA: Viene eseguito un secondo ciclo di genotipizzazione per confermare che le linee phaESC sotto-clonate possiedono eliminazioni sia dei DLF H19- che IG- e che gli alleli wildtype sono assenti dopo la rimozione dei MEF. Confermare al microscopio che le colture nei pozzi delle piastre a 24 pozzi del passaggio 5.11 sono libere da MEF.NOTA: Se si osservano MEF, è necessario continuare a far passare le colture fino a quando i MEF non sono scomparsi per evitare di contaminare la PCR con DNA di tipo selvatico dai MEF. Aspirare il mezzo da colture confluenti e aggiungere 400 μL di tampone di lysis per pozzo della piastra da 24 porri. Dopo aver pipettato più volte, trasferire la sospensione cellulare su un tubo da 1,5 ml. Incubare il tubo da 1,5 ml a 55 °C per 3 ore con miscelazione. Dopo l’incubazione, aggiungere 400 μL di isopropanolo al tubo da 1,5 ml e mescolare delicatamente fino a quando un precipitato di DNA diventa visibile. Centrifugare il tubo a ≥ 10.000 x g per 5 minuti e rimuovere il supernatante. Lavare il pellet di DNA con 200 μL di 70% di etanolo. Centrifugare il tubo a ≥ 10.000 x g per 5 minuti e rimuovere il supernatante. Asciugare il tubo nell’aria per 10 minuti e quindi rimospendre il DNA in 50 μL di acqua. Eseguire la PCR genotipizzante dopo il passaggio 4.7 e l’elettroforesi del gel nel passaggio 4.8 per identificare le linee cellulari, che possiedono eliminazioni sia dei DR H19- che IG- e sono libere da alleli wildtype.NOTA: Un’immagine di una tipica seconda analisi di genotipizzazione è mostrata nella figura 2B come riferimento. Nel nostro caso, tutte e 5 le linee cellulari selezionate dopo la purificazione delle cellule aploidi (fase 5) erano prive di alleli di tipo selvatico e possedevano solo gli alleli di eliminazione dei DR H19- e IG- . Utilizzare le linee phaESC sottodolonate selezionate dopo questo secondo genotipizzazione come linee DKO-phaESC. 7. Superovulazione dei topi Per la produzione di ovociti MII, avviare la superovulazione mediante iniezione intraperitoneale di 5 UI di soluzione di gonadotropina del siero di mare incinta (PMSG) in ogni topo femmina B6D2F1 (4-5 settimane) 63-65 ore prima della raccolta degli ovociti.NOTA: Lo sforzo del mouse B6D2F1 è raccomandato per questo protocollo perché gli ovociti B6D2F1 tollerano bene l’iniezione intracitoplasmatica e mostrano un elevato potenziale di sviluppo dopo la procedura17. Quarantotto ore dopo l’iniezione di PMSG, iniettare per via intraperitoneale 5 UI di soluzione di gonadotropina corionica umana in ogni topo. 8. Raccolta degli ovocite Preparare una piastra di 4 porvili contenente 700 μL di mezzo ialuronidasi in un pozzo e 700 μL di mezzo M2 nei restanti 3 pozzi. Inoltre, preparare un piatto di 6 cm con 7 mL di mezzo M2 e un piatto centrale-bene con 900 μL di mezzo M16. Preripidi il piatto e i piatti a 37 °C in un’atmosfera del 5% di CO2. Il giorno dell’iniezione intracitoplasmatica, eutanasiare le femmine superovulate (dal passo 7.2) per lussazione cervicale oinalazione di CO 2 intorno alle 8 del mattino. Sezionare gli ovidotti usando pinzette e forbici. Posizionare gli ovidotti nel piatto da 6 cm con mezzo M2. Rilasciare i complessi cumulo-ovocite (COC) strappando l’ampolla degli ovidotti con un ago da 30 G. Trasferire i COC in un mezzo di ialuronidasi pre-riscaldato e mantenere a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%. Dopo 2-3 minuti, raccogli gli ovociti senza cumulo con una pipetta per la bocca e lava gli ovociti 3 volte trasferendoli su mezzo M2 fresco negli altri 3 pozzi della piastra a 4 pozzetti. Raccogliere gli ovociti metafase II (MII), che possiedono i primi corpi polari, in un piatto centrale con mezzo M16 e mantenere la piastra a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5% fino all’uso per l’iniezione intracitoplasmatica nella fase 12. 9. Trattamento e raccolta di DKO-fasi Preparare una coltura DKO-phaESC in un pozzo di una piastra a 6 porvili senza MEF al 60-80% di confluenza il giorno prima dell’iniezione intracitoplasmatica (dal passaggio 5.11). Per indurre l’arresto del ciclo cellulare in fase M, aspirare completamente il mezzo e aggiungere 2 mL di mezzo eSE contenente 0,05 mg/mL di demecolicina. Dopo 8 ore di trattamento con demecolicina, aspirare il mezzo e aggiungere 800 μL di tripside. Incubare la piastra a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5% per 5 minuti, quindi aggiungere 2 mL di tampone di lavaggio per temprare la triparina e pipettare più volte per ottenere una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Centrifugare il tubo a 160 x g per 5 minuti e rimuovere il supernatante. Resuspend il pellet cellulare in 400 μL di tampone di manutenzione haESC contenente 15 μg/mL Hoechst 33342. Incubare la sospensione cellulare a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5% per 15 minuti. Dopo l’incubazione, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 5 ml attraverso un tappo del filtro cellulare e mantenere il tubo a 4 °C fino allo smistamento cellulare nel passaggio 10. 10. Purificazione dei DKO-phaESC arrestati in fase di fase M Impostare un citometro di flusso con un ugello da 100 μm secondo le istruzioni del produttore.NOTA: Hoechst 33342 può essere rilevato per eccitazione a 405 nm. Qui, un laser UV a 355 nm viene utilizzato per il rilevamento di Hoechst 33342. Impostare i DKO-phaESC arrestati in fase di fase M dal passaggio 9.7 e avviare l’analisi. Selezionare un cancello di smistamento adatto per la raccolta delle cellule aploidi della fase M (2n) dal campione trattato con demecolicina.NOTA: Dopo il trattamento con demecolicina, sono previste 2 popolazioni cellulari, corrispondenti a cellule aploidi e diploidi arrestate in fase M, come mostrato nella figura 3B. L’arresto del ciclo cellulare dopo il trattamento con demecolicina è completo, quindi non si osserva alcun picco di DNA aploide 1n. Questo è importante in quanto le cellule aploidi della fase M e le cellule G1 diploidi possiedono lo stesso contenuto di DNA (2n) e produrrebbero picchi sovrapposti. Impostare un tubo da 15 ml contenente 2 ml di tampone di manutenzione haESC per raccogliere le celle ordinate nel citometro di flusso. Avviare l’ordinamento delle celle. Dopo lo smistamento delle celle, aggiungere 5 ml di tampone di lavaggio lungo la parete del tubo di raccolta. Centrifugare il tubo a 160 x g per 5 minuti e rimuovere il supernatante. Rimescolare le cellule in un volume appropriato di tampone di manutenzione haESC per ottenere una concentrazione finale di 5 x 105 celle/mL. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l’iniezione intracitoplasmatica nella fase 12. 11. Preparazione di pipette di tenuta e microiniezione NOTA: Per eseguire l’iniezione intracitoplasmatica (fase 12), sono necessarie diverse pipette di tenuta e microiniezione(figura 4A). Queste pipette possono essere acquistate su richiesta su misura da un fornitore commerciale o realizzate con adeguati capillari in vetro utilizzando un estrattore di micropipette e una microforgia. Tirare i capillari di vetro borosilicato su un estrattore di micropipette. Per estrarre i capillari di vetro borosilicato senza filamento (0,78 x 1,00 x 80 mm) vengono forniti come riferimento i seguenti parametri per un estrattore orizzontale fiammeggiante(Tabelladei materiali), ma differiranno per altri strumenti e tipi capillari di vetro: Calore 510 (Ramp test 480), Pull 0, Velocità 150, Tempo 175 e Pressione 200 per il possesso di pipette; Calore 510 (rampa test 480), Pull 90, Velocità 140, Tempo 125 e Pressione 200 per pipette di microiniezione.NOTA: I parametri ottimali devono essere definiti individualmente perché diversi fattori tra cui l’umidità, il modello di un estrattore di micropipette e il lotto dei capillari di vetro possono influenzare la forma delle pipette di iniezione. Una forma allungata con una conica graduale dovrebbe essere mirata. Preparazione delle pipette di tenuta Impostare un capillare tirato preparato nel passaggio 11.1 su una microforgia. Posizionare il capillare sopra la perla di vetro sul filamento e abbassare il capillare per effettuare un contatto con la perla di vetro riscaldando il filamento. Rompere il capillare spegnendo il riscaldamento e staccandosi dalla perla di vetro in modo che il suo diametro esterno sia di 60-100 μm. Posizionare la punta capillare orizzontalmente per affrontare il tallone di vetro sul filamento. Riscaldare il filamento per consentire al diametro interno della punta capillare di sciogliersi ad un diametro di 10-20 μm. Spostare il capillare in modo che il tallone di vetro si posizioni in un punto ~ 1 mm dalla punta capillare senza contatto. Riscaldare il filamento per consentire al capillare di piegarsi con un angolo di 20°. Smontare il capillare, direttamente una pipetta di tenuta, dalla microforgia.NOTA: Per misurare le dimensioni del capillare, nel microforgia è preferibilmente installato un reticolo oculare. Preparazione di pipette di microiniezione Impostare un capillare tirato preparato nel passaggio 11.1 su una microforgia. Posizionare il capillare sopra la perla di vetro sul filamento e abbassare il capillare per effettuare un contatto con la perla di vetro riscaldando il filamento. Rompere il capillare spegnendo il riscaldamento e staccandosi dal tallone di vetro in una posizione in cui il suo diametro esterno è di 6 μm. Spostare il capillare in modo che il tallone di vetro si posizioni in un punto ~ 1 mm dalla punta capillare senza contatto. Riscaldare il filamento per consentire al capillare di piegarsi verso l’alto con un angolo di 20°. Smontare la pipetta di microiniezione dalla microforgia e conservarsi in una scatola sicura per un uso successivo.NOTA: Le pipette di microiniezione sono preparate con le seguenti specifiche: diametro esterno, 6 μm; diametro interno, 4,5-5 μm; angolo di piegatura, 20°. Definire il design ottimale della pipetta di microiniezione è importante per il successo dell’iniezione intracitoplasmatica. Un diametro interno troppo grande può impedire la rupturing della membrana plasmatica dei DKO-PHESC donatori (vedi sezione discussione). Se il diametro interno è troppo stretto, può impedire una pipettazione liscia dei DKO-PHESC donatori. Un angolo di piegatura < 30° è preferibile in quanto un angolo di piegatura elevato impedisce l'effetto degli impulsi piezo. 12. Iniezione intracitoplasmatica di DKO-fasi Prima dell’iniezione intracitoplasmatica (dal passaggio 12.2), preparare una soluzione di polivinilpirrolidone (PVP) aggiungendo 5 ml di mezzo M2 in un tubo da 50 ml contenente 0,6 g di PVP e agitando il tubo su un rocker a 4 °C per 2 giorni. Dopo che il PVP si è completamente sciolto, la soluzione viene filtrata sterilemente e conservata a 4 °C. Il giorno dell’iniezione intracitoplasmatica, preparare un piatto centrale con 900 μL di mezzo KSOM e pre-riscaldare il piatto a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%. Preparare una piastra di micromanipolazione allineando gocce di 5 μL di soluzione PVP e 20 μL di mezzo M2 su un coperchio di un piatto di 10 cm che viene posizionato capovolto. Coprire le gocce con olio minerale e posizionare il piatto sul palco del microscopio a iniezione.NOTA: La disposizione raccomandata della parabola di micromanipolazione è illustrata nella figura 4B. Installare una pipetta di tenuta sul micromanipolatore. Riempire la pipetta di microiniezione con l’olio di fluorocarbonio utilizzando una punta del microloader e montarla sull’attuatore piezo. Immergere la pipetta di microiniezione in una goccia con soluzione PVP e pipetta su e giù più volte per rivestire il vetro con PVP e renderlo meno appiccicoso. Caricare un piccolo volume di soluzione PVP nella pipetta di microiniezione e spostare la pipetta in una goccia con mezzo M2. Immergere la pipetta di tenuta nel mezzo M2 e concentrarsi sulla pipetta nella parte inferiore della goccia. Trasferire circa 2 μL di sospensione DKO-phaESC dal passo 10.6 nella caduta media M2. Trasferire 10 ovociti MII dal passo 8.5 nella stessa goccia media M2 utilizzando una pipetta per la bocca. Per l’iniezione, ruotare un ovocita nella caduta media M2 in modo che lo spazio perivitellino sia fronte alla pipetta di microiniezione e la piastra MII non si trovi nel percorso della pipetta di microiniezione (Figura 4A). Tenere l’ovocita applicando una pressione negativa attraverso la pipetta di tenuta.NOTA: Una piastra MII è visivamente identificata come una sporgenza di ooplasma che viene definita una “gobba” e spesso situata vicino al primo corpo polare. La lastra MII contiene il mandrino meiotico con cromosomi attaccati. Il contatto della pipetta di microiniezione e della piastra MII deve essere evitato in quanto i danni meccanici del mandrino e dei cromosomi possono interrompere lo sviluppo dell’embrione. Caricare un DKO-phaESC nella punta della pipetta di microiniezione applicando una leggera pressione negativa. Rottura della membrana plasmatica di un DKO-phaESC mediante pipettazione per evitare l’iniezione di un DKO-phaESC intatto (Figura 3C; vedi discussione).NOTA: Nel caso in cui la membrana plasmatica di un DKO-phaESC non si rompono con la pipettazione, scartare il DKO-phaESC e caricare un altro DKO-phaESC. Mettere la pipetta di microiniezione a contatto con la zona pellucida dell’ovocita e applicare una piccola quantità di pressione negativa all’interno della pipetta di microiniezione. Applicare impulsi piezoici (intensità, 20; frequenza, 4) per sfondare la zona spingendo la punta della pipetta di microiniezione verso lo spazio perivitellino. Verificare che la piastra MII, contenente un mandrino e cromosomi, non si trovi nel percorso della pipetta di microiniezione.NOTA: Regolare empiricamente l’impostazione agli impulsi piezoici più bassi per la perforazione attraverso la zona per ridurre al minimo la possibilità di danni all’oolemma. Scartare il frammento della zona pellucida dalla pipetta di microiniezione e posizionare il DKO-phaESC sul bordo della pipetta. Penetrare l’ovocita con la pipetta di microiniezione in modo che l’oolemma raggiunga il lato opposto.NOTA: Non toccare la piastra MII per evitare danni al mandrino e ai cromosomi. Applicare un impulso piezo (intensità, 6; frequenza, 1) per perforare l’oolemma. Assicurarsi che l’oolemma si rilassi lungo l’albero della pipetta di microiniezione.NOTA: Definire empiricamente l’impostazione più bassa dell’impulso piezo per rompere l’oolemma per ridurre al minimo il danno all’ovocita. Iniettare il DKO-phaESC con un volume minimo di mezzo nell’ooplasma e ritirare la pipetta di microiniezione senza intoppi dall’ovocita. Rilasciare l’ovocito iniettato dalla pipetta di tenuta e posizionarlo sul lato della microdrop per una successiva raccolta. Ripetere la procedura di iniezione dai passaggi da 12.9 a 12.17 per gli altri ovociti MII nella caduta media M2.NOTA: Evitare di tenere gli ovociti fuori dall’incubatrice per più di 20 minuti. Nella nostra esperienza, un lotto di 10 ovociti può essere manipolato comodamente entro 15 minuti dopo un allenamento appropriato. Trasferire il lotto di ovociti iniettati dalla goccia media M2 a un piatto centrale-pozzo preri riscaldato con mezzo KSOM. Conservare il piatto per 1 h a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%. Ripetere la manipolazione degli ovociti dai passaggi 12.5 e 12.20 con gruppi aggiuntivi di ovociti MII per ottenere abbastanza ovociti iniettati. 13. Attivazione di embrioni semi-clonati costruiti Preparare due piatti centro-bene con 900 μL ciascuno di mezzo KSOM e mezzo di attivazione. Preparare una piastra a 4 porvili con 700 μL di mezzo KSOM in ogni pozzo. Preripidi i piatti e il piatto a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%. Dopo 1 h nel mezzo KSOM, trasferire gli ovociti iniettati dal passo 12.21 nel piatto centro-pozzo prerifoto con mezzo di attivazione. Conservare il piatto per 6 ore a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5% per l’attivazione. Dopo l’attivazione, osservare alcuni embrioni semi-clonati formare tre corpi polari, che sono il primo e il secondo corpo polare dell’ovocita, e lo pseudo corpo polare del DKO-phaESC (Figura 3E). Lavare gli embrioni 3 volte trasferendoli in nuovi pozzi con mezzo KSOM in una piastra a 4 poggi. Trasferire gli embrioni nel piatto centrale con mezzo KSOM e mantenere il piatto a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5% per un ulteriore sviluppo. 14. Sviluppo di embrioni semi-clonati costruiti Dopo 1 giorno di coltura nel mezzo KSOM dal passo 13.6, diversi embrioni semi-clonati raggiungono lo stadio a 2 cellule (Figura 5A). Per un ulteriore sviluppo di embrioni preimpianto in vitro, continuare a coltivare gli embrioni semi-clonati nel mezzo KSOM a 37 °C in un’atmosfera di CO2 del 5%. Trasferire gli embrioni semi-clonati su un mezzo KSOM fresco al giorno 2. Al giorno 4, diversi embrioni raggiungeranno lo stadio di blastocista (Figura 5A). Per la derivazione di topi semi-clonati, trasferire embrioni a 2 cellule dal passaggio 14.1 negli ovidotti delle femmine riceventi pseudo-gravide. Identificare le femmine pseudo-gravide accoppiandole ai maschi vasectomizzati un giorno prima del trasferimento dell’embrione e selezionarle sulla base della presenza di una spina chiaramente visibile al mattino del giorno per il trasferimento dell’embrione (0,5 giorni dopo il coitum (dpc)). Circa 19,5 dpc, i cuccioli a tempo pieno vengono consegnati naturalmente dalle femmine riceventi (Figura 5B).