鶏胚のレチナから、ロッドからコーン細胞相互作用を研究するコーンエンリッチ培養

この議定書は、ピエール大学とマリー・キュリー大学の動物実験倫理委員会とフランス研究省(許可番号:APAFIS#1028 2015070211275177)によって承認されました。動物実験は次の認可の下で行われました: “セルティフィカト・ド・オートリゼーション・ド・デ・エクスペリメンター・シュル・レ・アニモー・ヴェルテブレA-75-1863。パリ警察のプレフェクチャー(2011年11月9日~2016年11月8日)」。 1. 受精卵のインキュベーション 産業孵化場で、自然に得られる毎週の受精卵(株I 657、赤いラベル)を収集します。 受精卵は鶏によって「産まれた」後、実験室で17°C(生物学的ゼロ)で維持します。 各培養物に対して、7個の受精卵を20°Cで24時間、37°Cで136時間培養し、加湿室で卵の傾斜(片側から反対側へ2時間の進行動、4時間周期)を間欠的に反転させます。 2. 鶏胚の回収 7個の卵の表面を消毒剤で洗います(例えば、Pursept A急行)。 卵殻を壊すために、大きなまっすぐなペンチでシェルの上部に穴を開けます。その後、殻を切って卵から帽子を柔らかいゆで卵として取り除きます。 卵殻から各胚を緩やかに引き出し、37°Cに加熱した無菌リン酸緩衝液生理塩水(PBS)を含むペトリ皿に移す。 胚(絨毛膜または絨毛管膜)を取り囲むエンベロープをそっと取り除きます。 ハンブルガーとハミルトン42と視覚的に比較して、各胚の発達段階を検証する。 開発の第29段階 で2つの胚を選択します(図1)。翼は肘で曲がる。襟が目に見えて目立ちます。法案は28番目 の段階よりも顕著です。 これらの選択した胚の目を核とし、CO2-独立培地(生命技術)でそれらを移す。注意: 胚がステージ 29 にあり、ステージ 28 または 30 (図1)にないことを非常に重要です。2個しか使わなくても、少なくとも7個の卵をインキュベートする必要があるのはそのためです。絨毛は非常に薄く、区別するのが難しいが、胚と非常に近いので、胚に触れることなく取り除かねばなっている。 3. レティナの解剖 切断し、湾曲した鉗子で選択した胚を核とします。 4つの目をCO2-独立培地に移します。この媒体は0.9 mM CaCl2 および0.65 mM MgCl2を含んでいる。 角膜を下にして眼を下に、実験者に向かって視神経を置く。2つのストレート鉗子を使用して視神経に穴を開けます。 網膜と色素上皮の間に各鉗子の分岐を挿入する(図2)。各鉗子を引っ張り、眼を回転させて網膜から上皮を取り外します。角膜を取り除き、レンズとガラス膜を取り除きます。 pH 7.2でリンガーの媒体を含むペトリ皿に4つのレチナを移します。注意:網膜だけが残っていることを確認し、色素性および残存網膜色素上皮の痕跡を取り除く。 4. 細胞の細胞懸濁液の準備 2つのまっすぐなペンチを使用して非常に小さな部分に4つのレチナをカットします。 リンガーの媒体で2回、レチンの部分を洗います。 リンガーの媒体で2回目の洗浄を行った後、レティナの破片をチューブの底に落とし、リンガーの媒体を取り除きます。トリプシン(0.25%w/v)の溶液で37°Cで20分間、レチナルピースを処理します。 連続吸引により10分後に溶液を分散させる。パスツールピペットを使用して排出し、レチナルピースの解離を確認します。10%不活性化胎児子牛血清を添加した培養培地を添加して反応を停止する。 DNase Iの0.05mgで細胞懸濁液をインキュベートし、DNaseを添加した直後にパスツールピペットを使用して連続吸引および排出することによって細胞クラスターとDNAを解震させる。 レチナル細胞懸濁液を化学的定義培養培地(CDCM)で2回洗浄する:100 μg/mLリノール酸/BSAを添加したダルベッコの修飾イーグル培地およびM199培地の等量 0.86 μMインスリン、0.07 μMトランスフェリン、2.0 μMプロゲステロン、0.28 μMプロスタグランジン、0.29 μM Na2SeO 3、182 μM プトレシン、3 mMタウリン、 4.7 μMシチジン5′ジホスホコリン、2.7 μMシチジン5’ジホスホエタノールアミン、0.55 μMヒドロコルチゾン、0.03 μMトリヨードチロニン、1 mMナトリウムピルビン酸、20μMゲンタマイシン。 5. レティナル細胞の播種 37°Cで2時間透明な底を持つ2つの黒い96ウェル培養プレートをポリL-リジンで32.25 μg/cm2で扱います。 これらのプレートをM199培地で2回リンスします。CDCMの1 mLで細胞ペレットを再懸濁する。 細胞懸濁液トリパンブルーの10μLのアリコートに加えて、生きている細胞を染色します。細胞懸濁試料を血球計(マラッセの細胞計数室)に加える。 顕微鏡下で、血球計の4列(すなわち40四角)の染色された細胞を数え、1行の平均細胞数を計算する。懸濁液の細胞の濃度を計算するには、次の方法を適用します: 細胞/mLの懸濁液の数 = 行内の平均セル数 (10 四方) x 10 トリパンブルー x 1,000 での血球減少の総平方数を 1,000 (セル/mL として結果を表す) CDCMを使用して、2つのめっき密度(1 x 105細胞/cm2および2 x 10 5細胞/cm2)に対応する2つの濃度(5.6 x 104細胞/mLおよび1.12 x 105細胞/mL)に細胞懸濁液を持って来なさい。 2つの細胞懸濁液の種子50μLを、2つの前処理された黒96ウェル培養プレートに入った。プレートの右側から左側にマルチチャンネルピペットを使用してプレート内の細胞を分配し、各カラム間で均質化し、細胞の分布が均質になるようにします。 あらかじめ定義されたパターンを用いてスクリーニングされる分子のライブラリの50μL(例えば、cDNAライブラリからのコンディションされたメディア、下記参照)を加える(表1)。 培地交換なしで、37°CのCO2 の下で7日間プレートをインキュベートします。 6. 生存可能な細胞を数える プレートの各ウェルに、カルセインAMの2.7 μMとエチジウムホモモマーの0.3 mMを加えます。注:カルセインは、エチジウムホモメータとして大きな分子に不浸透性である細胞を貫通します。生細胞の細胞質では、カルセインは内因性エステラーゼによって加水分解され、485nmで励起されると520nmで発光することにより蛍光化する。エチジウムホモジマーは死んだ細胞上のDNAに結合する。エチジウムDNA-ホモジマー結合は、520nmで励起した後、635 nmで赤色蛍光を放出する。 光が当たらなくて室温でプレートを1時間インキュベートします。 485と520 nmの2つの励起フィルターを備えた水銀ランプを備えた反転顕微鏡、520および635 nmの2つの発光フィルター、目的(x10)、プロセッサと電荷結合デバイスカメラ(CCD)によって制御される電動ステージで構成された自動プレートリーダーで蛍光を読み取ります。このカウントプラットフォームは、メタモルフソフトウェア19によって制御されます。96ウェルプレートの各ウェルで生きている細胞と死細胞の蛍光画像を同時に取得し、ウェルA1からウェルA12に向かい、次いでB12からB1に向かって、C12に向かってC12などを得ることを可能にする(表I)。 負のコントロールの 18 ウェルを使用して、単一セルの平均領域 A を計算します (表 I)。 各プレートウェル内のセルをカウントし、次の経験的な式A x 29 / 20.7を適用して、セルダブレット(2つのセルのグループ化)がカウントされるのを防ぎます。分子による円錐の保護効果を、負の対照の18ウェル内の分子対平均細胞数を試験した4つのウェルにおける平均細胞数との比率としてスコアを付けます( 表1 および 補足図1を参照)。 1 x 105 細胞/cm2 で播種したプレートの結果と2 x 105 細胞/cm2 で播種したものを組み合わせて、スクリーニングされた各分子による潜在的保護(生存率)を評価します。