Utilización de Grafix para la detección de interactores transitorios de subcomplejos de Saccharomyces cerevisiae Spliceosome
Summary
Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), una centrifugación de gradiente de glicerol en presencia de un ticulador, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas.
Abstract
El empalme pre-ARNm es un proceso muy dinámico que implica muchos reordenamientos moleculares de los subcomplejos del espliceosoma durante el ensamblaje, el procesamiento del ARN y la liberación de los componentes complejos. La centrifugación por gradiente de glicerol se ha utilizado para la separación de complejos de proteínas o RNP (RiboNucleoProtein) para estudios funcionales y estructurales. Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), que se desarrolló por primera vez para purificar y estabilizar complejos macromoleculares para microscopía crio-electrónica de partículas individuales, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas. Este método se basa en la centrifugación de muestras en una concentración creciente de un reactivo de fijación para estabilizar complejos. Después de la centrifugación de los extractos totales de levadura cargados en gradientes de glicerol, las fracciones recuperadas se analizan por punto blot para la identificación de los sub-complejos de espliceosomas y la determinación de la presencia de factores de empalme individuales.
Introduction
El empalme es un proceso altamente dinámico que requiere la unión y liberación de una multitud de factores de manera coordinada. Estos factores de empalme incluyen proteínas de unión a ARN, ATPasas, helicasas, proteínas quinasas y fosfatasas, ligasas de ubiquitina, entre otras1,2,3; y para permitir que se produzcan los reordenamientos moleculares, algunos de estos factores se unen muy transitoriamente a los subcomplejos del espliceosoma, lo que hace que el aislamiento y la identificación de estos complejos intermedios de RNP sean muy difíciles.
Aquí, utilizamos el método grafix4,5 para estabilizar la interacción del factor de empalme de levadura Cwc24 con el complejo deacto B6 para permitir la identificación de otros factores unidos concomitantemente a ese subcomplejo y determinar si la ubiquitina ligasa Prp19 juega algún papel en la unión o liberación de Cwc24 al complejo Nineteen (NTC) y al extremo 5′ del intrón antes de la activación y la primera reacción de transesterificación toma lugar. La ventaja de exponer las macromoléculas a una concentración creciente del reticulador a lo largo del gradiente de glicerol es que evita los enlaces cruzados inter-complejos4,5y, por lo tanto, la formación de agregados.
Este método se utilizó como complemento a los ensayos de coinmunoprecipitación de proteínas y pull-down, que, a pesar de permitir el aislamiento de grandes complejos, pueden no ser confiables para mantener interacciones transitorias dentro de grandes complejos dinámicos7,8. El uso de reactivos de fijación en el gradiente de glicerol estabiliza la unión de dichos factores, permitiendo la confirmación de interacciones de proteínas específicas con subcomplejos de empalme. Debido a que el reticulador elegido era químicamente irreversible, las proteínas presentes en las fracciones recuperadas se analizaron mediante puntos secantes después de la centrifugación por gradiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las interacciones proteína-proteína y ácidos ribonucleicos-proteína se pueden estabilizar utilizando agentes ticuladores. Es importante que el complejo resultante sea estable para soportar la ultracentrifugación en el gradiente de glicerol. Además, las condiciones del búfer deben permitir la interacción, pero ser lo suficientemente estrictas como para evitar la unión no específica. En los experimentos aquí mostrados, utilizamos una solución tampón ya establecida para reacciones de empalme in vitro<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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